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羟基喜树碱和去甲斑蝥素对肿瘤及其宿主细胞区别杀伤作用的研究

作　者: 王敏
导　师: 孙震晓
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中药制药学
关键词: 共培养体系人肺腺癌细胞A549 人胚肺成纤维细胞MRC-5 羟基喜树碱去甲斑蝥素区别杀伤
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

肿瘤是人类健康的大敌,其治疗也主要是手术切除、放疗与化疗。近年来,中药及其活性成分在临床上用于抗肿瘤的治疗越来越受到各界学者的关注。喜树碱(camptothecin,CPT)是分离自珙桐科植物喜树(Camptotheca acuminate Decne)的一种五环生物碱,是迄今发现的唯一有选择性抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)的抗癌植物药。10-羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine HCPT)的化学结构与CPT相似,是后来分离自喜树的另一种抗癌活性成分。HCPT与CPT相比,毒性小,疗效更好,现已广泛用于临床,主要用于非小细胞肺癌、肝癌和膀胱癌等肿瘤的治疗。斑蝥(mylabris)系鞘翅目芫青科昆虫,南方大斑蝥或黑黄小斑蝥的干虫体均可入药,在我国用于肿瘤的治疗已有两千余年的历史,具攻毒蚀疽、破血散结的作用。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)是在对斑蝥抗肿瘤有效成分斑蝥素(canthaidin)的构效关系研究基础上,由人工合成而来。NCTD在具有显著抗肿瘤活性的同时能升高外周血白细胞数,现广泛用于临床,主要用于肝癌、肺癌等的治疗。目前,大多数抗癌药物在对癌细胞有效杀伤的同时,对其正常宿主细胞的杀伤作用也不可忽视,甚至一些药物对正常细胞的杀伤大于肿瘤细胞。因此,研究药物对肿瘤和宿主细胞的区别杀伤作用显得尤为重要和迫切。本文选用同一组织来源的人肺腺癌细胞(A549)和宿主人胚肺成纤维细胞(MRC-5),用不同浓度HCPT和NCTD作用不同时间,研究这两种药物对肿瘤和宿主的区别杀伤作用。结果显示:50-100μmol/L的HCPT在0-72h对A549杀伤作用均大于MRC-5,但作用72h时,对MRC-5杀伤作用也很大,HCPT对两种细胞的半数抑制浓度均＜50μmol/L;30-60μmol/L的NCTD在作用24h时,对A549的杀伤作用强于MRC-5,而作用48h和72h时对MRC-5的杀伤超过A549。通过药物脉冲作用细胞24h后恢复培养5天发现,实验剂量范围内HCPT对A549和MRC-5的生长抑制作用在停止药物作用后1天之内仍然存在,但杀伤A549强于MRC-5的区别杀伤作用在恢复培养中不明显,两种细胞生长与对照相比均未恢复;实验剂量范围内NCTD对A549和MRC-5的生长抑制作用在停止药物作用后马上消失,但杀伤A549强于MRC-5的区别杀伤作用在恢复培养时仍然存在,表现为30μmol/LNCTD剂量组MRC-5生长恢复较快,恢复培养3天时与对照组相比无显著性差异,而A549需要5天。用30μmol/L的NCTD和50μmol/L的HCPT作用细胞,收集细胞进行流式细胞术,结果显示:50μmol/L的HCPT引起A549细胞S期阻滞,且48h后凋亡率明显增加,而MRC-5则只显示明显S期阻滞;30μmol/L的NCTD能引起A549和MRC-5的G2-M期阻滞,A549强于MRC-5,但NCTD作用48h后MRC-5凋亡率有小幅度升高。因此,认为HCPT和NCTD对A549和MRC-5的细胞周期和凋亡影响不同,是这两种药物在一定时间和剂量范围内对两种细胞存在区别杀伤作用的原因之一。为使抗癌药敏试验研究更贴近体内环境,在体外建立了一种肿瘤和宿主细胞的共培养体系,并在此条件下研究A549和MRC-5对HCPT和NCTD的敏感性。结果显示:A549在单独培养和与MRC-5共培养时对HCPT和NCTD的敏感性没有区别;MRC-5在与A549共培养12h和72h时对HCPT较单独培养时敏感,共培养12h和24h时对NCTD较单独培养时敏感。

全文目录

目录  3-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-9
英文缩略词  9-12
1 文献综述  12-33
  1.1 羟基喜树碱的研究进展  12-20
    1.1.1 羟基喜树碱的概述  12-13
    1.1.2 羟基喜树碱的抗肿瘤活性及机理研究  13-18
      1.1.2.1 DNA 拓扑异构酶Ⅰ抑制剂  13-14
      1.1.2.2 阻断细胞周期  14
      1.1.2.3 促进肿瘤细胞凋亡  14-16
      1.1.2.4 影响真核细胞核转录因子 NF-κB 的表达  16-17
      1.1.2.5 影响细胞内 Ca~(2+)的流动  17
      1.1.2.6 其它  17-18
    1.1.3 羟基喜树碱的临床应用  18-20
      1.1.3.1 羟基喜树碱的临床应用  18-19
      1.1.3.2 羟基喜树碱的剂型研究  19-20
  1.2 去甲斑蝥素的研究进展  20-30
    1.2.1 去甲斑蝥素概述  20-21
    1.2.2 去甲斑蝥素的体内外抗肿瘤活性及其机理研究  21-28
      1.2.2.1 抑制肿瘤细胞的粘附、侵袭、转移  21-22
      1.2.2.2 抑制肿瘤组织的血管生成  22-23
      1.2.2.3 抑制肿瘤细胞 DNA 和蛋白质的合成  23-25
      1.2.2.4 诱导肿瘤细胞凋亡  25-26
      1.2.2.5 影响肿瘤细胞超微结构  26-27
      1.2.2.6 通过调节免疫系统、升高白细胞发挥抗肿瘤作用  27-28
      1.2.2.7 其它  28
    1.2.3 去甲斑蝥素的临床研究  28-30
      1.2.3.1 去甲斑蝥素的临床研究  28-29
      1.2.3.2 去甲斑蝥素的剂型研究  29-30
  1.3 药物对肿瘤和宿主细胞的区别杀伤作用及其机理研究  30-32
  1.4 问题与展望  32-33
2 前言  33-34
3 实验材料和方法  34-39
  3.1 实验材料  34-36
    3.1.1 细胞及其培养基等  34
    3.1.2 主要试剂  34-35
    3.1.3 主要仪器  35
    3.1.4 主要溶液配制  35-36
  3.2 实验方法和步骤  36-39
    3.2.1 细胞培养  36
    3.2.2 细胞计数  36-37
    3.2.3 药物持续作用0-72h 生长曲线分析  37
    3.2.4 药物脉冲作用24h,恢复培养5d 研究分析  37
    3.2.5 流式细胞术测定细胞周期、细胞凋亡  37-38
    3.2.6 共培养体系的建立及抗肿瘤药物敏感性研究  38
    3.2.7 数据处理方法  38-39
4 实验结果  39-58
  4.1 羟基喜树碱及去甲斑蝥素对肺癌 A549和其宿主成纤维细胞 MRC-5的区别杀伤作用研究  39-46
    4.1.1 羟基喜树碱及去甲斑蝥素对 A549和 MRC-5的区别杀伤作用研究  39-46
      4.1.1.1 药物持续作用0-72h 生长曲线分析  39-44
      4.1.1.2 药物脉冲作用 A549和 MRC-5 24h,恢复培养5d 研究分析  44-46
  4.2 羟基喜树碱及去甲斑蝥素对肺癌 A549和其宿主成纤维细胞 MRC-5产生区别杀伤作用的机制初探  46-55
    4.2.1 羟基喜树碱及去甲斑蝥素作用 A549和 MRC-5形态学观察结果  47-50
      4.2.1.1 羟基喜树碱作用 A549和 MRC-5形态学观察结果  47-48
      4.2.1.2 去甲斑蝥素作用 A549和 MRC-5形态学观察结果  48-50
    4.2.2 羟基喜树碱及去甲斑蝥素作用 A549和 MRC-5细胞周期分析  50-55
      4.2.2.1 羟基喜树碱作用 A549和 MRC-5细胞周期分析  50-52
      4.2.2.2 去甲斑蝥素作用 A549和 MRC-5细胞周期分析  52-55
  4.3 细胞共培养体系的建立及 A549和 MRC-5对抗肿瘤药物敏感性的研究  55-58
    4.3.1 细胞共培养体系的建立及 A549和 MRC-5在该体系下的生长特性研究  55-56
    4.3.2 羟基喜树碱及去甲斑蝥素在细胞共培养和单独培养条件下的作用比较  56-58
5 讨论  58-63
  5.1 羟基喜树碱对 A549和 MRC-5区别杀伤作用及其机制研究  58-60
  5.2 去甲斑蝥素对 A549和 MRC-5区别杀伤作用及其机制研究  60-61
  5.3 共培养体系的建立及 A549和 MRC-5对抗肿瘤药物敏感性的研究  61-63
6 小结  63-64
7 参考文献  64-69
8 致谢  69-70
9 个人简历  70

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