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猪体细胞核移植转基因技术的研究

作　者: 顾晓龙
导　师: 曾宪垠；张德福
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物物理
关键词: 猪核移植体细胞重构胚共培养体系纺锤体
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪体细胞核移植转基因技术在人的动物疾病模型和人类异种器官移植方面具有巨大优势和应用潜力,同时还有望猪育种中应用,甚至生产“环保猪”。它现在已经成为研究的热点。本研究以建立高效的猪体细胞核移植转基因技术体系为目的,并尝试构建转植酸酶基因胚胎,为以后生产“环保猪”打下坚实的基础。本试验比较观察第一极体(The first polar body, pbⅠ), Oosight imaging system观察和hocchst33342染色法对第二次减数分裂中期(Metaphase II, MⅡ)卵母细胞判定结果的相关性分析,并探讨卵巢皮质细胞(porcine ovarian cortex cells, pOCCs),猪输卵管上皮细胞(porcine oviductal epithelial cells, pOECs)和猪卵丘颗粒细胞(porcine cumulus cells, pCCs)三种单层细胞体外共培养体系对猪去卵丘卵母细胞(cumulus cells denuded oocytes,Dos)体外成熟(in vitro maturation, IVM)和孤雌发育的影响。结果显示：(1) Oosight imaging system判定卵母细胞成熟的结果与hocchst33342染色法判定的结果有很强相关性(R=0.973, P<0.01, N=90); (2) pOCCs单层细胞共培养体系中猪去卵丘卵母细胞成熟率显著高于pOECs (52.5±0.30% vs 43.8±2.18%, P<0.05),且这两组成熟率显著高于其余各组(P<0.05); Dos在三种单层细胞共培养体系培养后,成熟卵母细胞GSH含量较非共培养组都能显著升高(P<0.05), pOCCs组GSH含量最高(7.1±0.32pmol/卵)；(3)成熟后的Dos经孤雌激活,pOCCs组和pOECs组卵裂率和囊胚率都显著高于其余两组(P<0.05)。建立了枫泾猪的35d胎儿成纤维细胞系、成年耳成纤维细胞系,输卵管上皮细胞系,并分离培养了猪卵泡液中的颗粒细胞。且比较了脂质体介导法中DNA含量、脂质体含量和孵育时间对转染效率的影响。结果显示,四种细胞系通过24孔板内细胞汇合85%-90%, 1.0μg DNA和2.4μL脂质体的用量,孵育4h转染YM6552质粒效率最高。且四种细胞系对脂质体介导法条件要求一致。其中胎儿成纤维细胞的转染效率最高。在体细胞核移植转基因过程中,我们通过LipofectamineTM2000介导YM6552质粒转染四种供核细胞,并且采用G418对其进行筛选。通过筛选出来的稳定的转染YM6552的细胞做供核细胞,获得了表达绿色荧光蛋白的重构胚胎。在构建重构胚胎的同时比较了四种转染后的供核细胞对重构胚体外发育的影响。结果表明,胎儿成纤维细胞在转染YM6552质粒后能够获得最高的卵裂率和囊胚率。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
论文缩略词表  8-12
第一章猪体细胞核移植转基因技术的研究与应用  12-21
  1. 猪转基因克隆研究简要回顾  12-13
  2. 转基因克隆技术在猪育种中的应用  13-16
    2.1 生产高繁殖力猪  13-14
    2.2 提高抗病能力  14
    2.3 猪肉肉质改良  14-16
  3. 猪转基因克隆技术在人类医学中的应用  16-18
    3.1 异种器官移植  16-17
    3.2 医学研究模型  17
    3.3 生物反应器  17-18
  4. "环保猪"  18-19
  5. 展望  19-21
第二章单层细胞共培养对猪去卵丘卵体外成熟及发育能力的影响  21-32
  1. 材料与方法  22-27
    1.1 材料  22-25
      1.1.1 主要仪器与试剂  22-23
      1.1.2 溶液的配制  23-25
    1.2 方法  25-27
      1.2.1 共培养单层细胞的制备  25-26
      1.2.2 卵母细胞的采集,Dos的获得和体外成熟  26-27
  2 结果  27-29
    2.1 不同卵母细胞MⅡ期判定方法的相关性分析  27
    2.2 不同单层细胞共培养体系对Dos体外成熟及孤雌胚胎早期发育的影响  27-29
  3 讨论  29-32
    3.1 Spindle-view对猪卵母细胞达到MⅡ期判定的适用性  29
    3.2 不同单层细胞共培养体系对Dos IVM成熟的影响  29-32
第三章植酸酶基因转染  32-41
  1. 材料与方法  33-38
    1.1 实验材料  33-34
    1.2 实验方法  34-38
      1.2.1 成年猪耳成纤维细胞系建立  34
      1.2.2 胎儿成纤维细胞系建立  34
      1.2.3 猪卵巢颗粒细胞系建立  34-35
      1.2.4 猪输卵管上皮细胞系建立  35
      1.2.5 细胞传代培养  35
      1.2.6 供体细胞液氮冷冻储存  35
      1.2.7 供体细胞的复苏  35-36
      1.2.8 植酸酶基因的转染  36
      1.2.9 转染效率的检测  36-38
  2 结果  38-39
    2.1 不同YM6552质粒含量对转染效率的影响  38
    2.2 不同脂质体含量对转染效率的影响  38-39
    2.3 DNA/脂质体复合物的孵育时间对转染效率的影响  39
  3. 讨论  39-41
第四章体细胞核移植转基因胚的构建及早期发育  41-50
  1. 材料与方法  41-46
    1.1 试剂  41-42
    1.2 仪器  42
    1.3 显微操作工具的制备  42-43
    1.4 方法  43-46
      1.4.1 卵母细胞体外成熟  43-44
      1.4.2 转植酸酶基因供体细胞的筛选  44-45
      1.4.3 核移植供体细胞的准备  45
      1.4.4 受体卵母细胞去核  45
      1.4.5 去核卵母细胞的核移植  45-46
      1.4.6 融合与激活  46
      1.4.7 胚胎培养  46
  2. 结果  46-48
    2.1 不同供核体细胞对G418浓度的敏感性  46-47
    2.2 不同转基因供体细胞类型对重构胚体外发育的影响  47
    2.3 表达绿色荧光蛋白的核移植转植酸酶基因胚胎的获得  47-48
  3 讨论  48-50
    3.1 不同供核体细胞对G418浓度的敏感性  48
    3.2 不同转基因供体细胞类型对重构胚体外发育的影响  48-49
    3.3 表达绿色荧光蛋白的核移植转植酸酶基因胚胎的获得  49-50
结论  50-51
参考文献  51-58
致谢  58-59
攻读学位期间发表的学术论文目录  59

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