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羟基喜树碱对人增生性瘢痕成纤维细胞P-Smad3表达影响和兔耳增生性瘢痕作用的实验研究

作　者: 余冬平
导　师: 廖立新
学　校: 南昌大学
专　业: 外科学
关键词: 羟基喜树碱增生性瘢痕成纤维细胞 P-Smad3 兔耳
分类号: R622
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

病理性瘢痕的防治是烧伤整形科的一个难题。目前治疗病理性瘢痕的方法有很多,主要有手术、药物、放射、冷冻、压力等,这些治疗方法虽然取得了一定的试验或临床治疗效果,但远期疗效、满意度远远没有达到患者要求的程度,甚至一些治疗方法可以产生严重的并发症,这也给病理性瘢痕的治疗带来了更大的阻力,因此研究一种安全有效、方便可靠的治疗方法仍是广大医务工作者的艰难任务。至今,病理性瘢痕的治疗仍未取得突破性的进展,和病理性瘢痕发生、发展、转归的机制研究发展较慢密切相关。病理性瘢痕是人体对创伤产生过度愈合反应的结果,主要包括增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)和瘢痕疙瘩(keloid, K),它们都以成纤维细胞(fibroblast, FB)的大量增殖和细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的过度沉积为特征。目前对病理性瘢痕的研究主要从成纤维细胞、组织胶原、细胞生长因子、基因研究、动物瘢痕模型等方面进行,以期待了解病理性瘢痕的形成机制,从而为临床防治病理性瘢痕提供科学的理论依据。目的：拟通过羟基喜树碱(hydroxycamptothecin, HCPT)对人增生性瘢痕成纤维细胞进行培养干预,检测成纤维细胞P-Smad3mRNA及蛋白,以期了解TGF-β/Smad信号转导通路中信号介导子Smad3在增生性瘢痕发病机制中的作用。同时,应用羟基喜树碱局部注射兔耳增生性瘢痕模型,证实其对增生性瘢痕的治疗作用,进一步了解其防治机制,为临床研究提供可靠的理论依据。方法：1、人增生性瘢痕标本取自本院整形科患者,采用改进组织块培养法体外培养成纤维细胞后,分为：空白对照组及实验组。空白对照组,细胞仅加入成纤维细胞培养基；实验组：细胞加入成纤维细胞培养基和不同浓度羟基喜树碱,药物浓度分别为125、250、500ng/ml三个浓度,作用培养24小时。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR法)检测P-Smad3mRNA表达,蛋白印迹法(Western-blot)法检测P-Smad3蛋白表达。2、新西兰大白兔25只,双侧兔耳腹侧面制作增生性瘢痕动物模型。待瘢痕形成后随机分为4组。分别于瘢痕基底部及瘢痕内注射羟基喜树碱或生理盐水,注射总用量为60μl。A组：生理盐水,B组：1.25mg/ml,C组：2.5 mg/ml,D组：5 mg/ml。每组用药：一次/3天。继续喂养4周。分别于注药后2、4周切取瘢痕组织做HE染色,免疫组化测Bcl-2、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达,Western-blot检测Cx43蛋白的表达。结果：1、各浓度HPCT作用24小时后P-Smad3mRNA表达水平光密度比值为：500 ng/ml组(157.66±14.39),250 ng/ml组(235.75±20.82),125 ng/ml组(321.644±29.26),空白组(398.23±35.45),各组差异有统计学意义(P<0.05)；P-Smad3蛋白表达水平光密度比值两两比较也有差异(P<0.05)。实验结果表明,各浓度(125、250、500ng/mL)HCPT作用后增生性瘢痕成纤维细胞P-Smad3mRNA及蛋白表达均降低。其中,500ng/mL浓度组抑表达作用最强。2、2.5mg/ml组(C组)、5.0mg/ml组(D组)在注药2、4周时较对照组(A组)、1.25mg/ml组(B组)瘢痕颜色变浅,体积减小,质地变软,胶原少而齐整,与注药时间正相关；C组、D组与A组、B组两两间比较瘢痕增生指数、成纤维细胞数差异有统计学意义(P<0.01)；1.25mg/ml组与对照组比较无明显差异(P>0.01)。PCNA、Bcl-2阳性表达率：C组、D组在注药2、4周时与对照组、1.25mg/ml组两两间差异有统计学意义(P<0.01),B组与对照组比较无明显差异(P>0.01)。Cx43蛋白表达水平光密度比值：C组(157.46±17.55)、D组(193.68±±18.35)与A组(120.12±12.36)、B组(126.37±13.86),两两比较差异有统计学意义(P<0.01)；B组与对照组对比无明显差异(P>0.01)。结论：1、羟基喜树碱对人增生性瘢痕成纤维细胞P-Smad3mRNA及蛋白表达有明显的抑制作用,对防治增生性瘢痕有一定意义。2、羟基喜树碱能够抑制兔耳瘢痕的增生,机理可能是减少PCNA、Bcl-2和增加Cx43的表达,从而减少成纤维细胞增殖,促进其凋亡,增加细胞间缝隙连接通讯,这又为临床应用羟基喜树碱治疗增生性瘢痕提供了科学依据。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第1章引言  11-13
第2章羟基喜树碱对人增生性瘢痕成纤维细胞 P-Smad3mRNA及蛋白的影响  13-29
  2.1 材料与方法  13-24
    2.1.1 主要材料及仪器  13-16
    2.1.2 增生性瘢痕成纤维细胞的分离、培养、传代及羟基喜树碱培养干预  16-17
    2.1.3 RT-PCR法检测羟基喜树碱对人增生性瘢痕成纤维细胞P-Smad3mRNA表达的影响  17-20
    2.1.4 Western-blot法检测羟基喜树碱对人增生性瘢痕成纤维细胞P-Smad3蛋白表达的影响  20-23
    2.1.5 统计学处理  23-24
  2.2 结果  24-26
    2.2.1 成纤维细胞的分离培养  24
    2.2.2 RT-PCR结果  24-25
    2.2.3 Western-blot结果  25-26
  2.3 讨论  26-29
第3章羟基喜树碱对兔耳增生性瘢痕作用的实验研究  29-40
  3.1 材料与方法  29-32
    3.1.1 实验动物与材料  29-30
    3.1.2 实验方法  30-31
    3.1.3 统计分析  31-32
  3.2 结果  32-35
    3.2.1 大体标本观察  32
    3.2.2 HE染色  32-33
    3.2.4 免疫组化结果  33
    3.2.5 Western-blot结果  33-35
  3.3 讨论  35-40
    3.3.1 HCPT的药理作用  35
    3.3.2 HCPT与增生性瘢痕成纤维细胞增殖与凋亡  35-37
    3.3.3 HCPT与增生性瘢痕缝隙连接  37-40
第4章结论  40-41
致谢  41-42
参考文献  42-46
附图  46-52
攻读学位期间的研究成果  52-53
综述  53-62
  参考文献  59-62

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