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幽门螺杆菌Cag致病岛中hp0523基因功能的鉴定与分析

作　者: 钟桥
导　师: 邵世和
学　校: 江苏大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 幽门螺杆菌 Cag致病岛 IV型样分泌装置 肽聚糖水解酶
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）的细胞毒性蛋白A（CagA）是一个重要的毒力因子,与胃癌的发生密切相关。其是通过Cag致病岛（cagpathogenicity island,Cag-PAI）编码的Ⅳ型样分泌装置,转运进入胃上皮细胞,发挥毒性作用。而Cag-PAI中编码的基因功能及其致病机理均尚未十分明确。鉴此,本文初步研究了Cag-PAI中编码的hp0523基因的功能,并初步探讨其在CagA转运过程中的作用,旨在为深入研究Cag-PAI的致病机理奠定基础。方法:1.利用PCR技术从H.pylori基因组DNA中扩增获取hp0523基因,T-A克隆后构建pGEM-T-hp0523,进行序列测定;并对其序列进行生物信息学分析研究;2.构建pET-28a-hp0523原核表达载体,转化表达宿主菌BL21（DE3）;经IPTG诱导后,SDS-PAGE法和Western blot法鉴定表达后,并以Ni2+-NTA柱分离纯化目的蛋白;进一步对纯化蛋白进行生物学活性研究;3.扩增获得hp0523基因上下游同源臂片段F1、F2,构建自杀质粒pBlueKM40/△hp0523::Kmr,电击转化H.pylori后经抗生素筛选hp0523基因缺失株,再进行PCR鉴定;4.采用hp0523基因缺失株和野生株与胃癌上皮细胞BGC-823进行共培养,而后采用Western blot法检测CagA蛋白转运能力变化。结果:1.扩增获得的hp0523基因全长为510bp,编码169aa,与GenBank公布的26695、J99同源性为92～95%;蛋白相对分子量Mr预测为19.7kDa,等电点pI为9.53;蛋白二级结构分析,在33～165位aa之间存在一个保守的SLT催化基序,第56位谷氨酸（GLU56）是催化活性的中心位点,C端序列上含有一个肽聚糖结合域“AVGAY”,故预测hp0523基因可能是一个肽聚糖水解酶编码基因;2.构建获得了原核表达载体pET-28a-hp0523,IPTG诱导后,经SDS-PAGE鉴定和Western blot鉴定有目的蛋白表达;采用Ni2+-NTA柱梯度洗脱后,分离获得了目的蛋白HP0523;3.HP0523经复性处理后,采用溶菌斑点实验证实其具有溶菌活力;而后采用SDS煮沸法分离提取获得细菌肽聚糖,进行凝胶酶谱分析后,发现HP0523蛋白具有肽聚糖水解能力;理化特性研究表明,HP0523具有广谱的溶菌能力,但酶活力较溶菌酶低;其最适酶活力pH值为6.0;4.连接F1、F2后构建自杀质粒pBlueKM40/△hp0523::Kmr,电击转化后经抗生素筛选,并经PCR验证后获得了hp0523基因缺失株;缺失株、野生株分别与胃癌上皮细胞BGC-823进行共培养后,发现hp0523基因缺失株处理组,胃癌上皮细胞内未能检测到CagA的转运。结论:本研究认为hp0523基因是一个肽聚糖水解酶的编码基因,且其参与CagA的转运,可能是Cag-PAIⅣ型样分泌装置的组成成分之一。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-14
第一章 绪论  14-24
  1.1 研究背景  14-21
    1.1.1 幽门螺杆菌Cag致病岛  14-15
    1.1.2 癌蛋白CagA的致癌机理  15-16
    1.1.3 CagA蛋白的转运机制——Ⅳ型样分泌装置  16-19
    1.1.4 细胞壁的屏障作用和肽聚糖水解酶  19-20
    1.1.5 细菌的分泌转运装置与肽聚糖水解酶  20-21
  1.2 本研究的目的、内容及其技术路线  21-24
    1.2.1 研究目的  21
    1.2.2 研究内容  21-22
    1.2.3 技术路线  22-24
第二章 幽门螺杆菌hp0523基因的克隆及其序列分析  24-34
  2.1 材料  24-26
    2.1.1 菌株和载体  24
    2.1.2 主要试剂  24
    2.1.3 主要溶液  24-26
    2.1.4 主要仪器  26
  2.2 方法  26-30
    2.2.1 H.pylori的培养与鉴定  26
    2.2.2 H.pylori基因组DNA的制备  26-27
    2.2.3 PCR引物的设计  27
    2.2.4 PCR反应  27
    2.2.5 目的DNA片段的回收  27-28
    2.2.6 氯化钙法制备感受态细胞  28
    2.2.7 目的片段的T-A克隆  28-29
    2.2.8 转化与筛选  29
    2.2.9 重组质粒的鉴定  29-30
    2.2.10 重组质粒中目的基因序列测序  30
    2.2.11 hp0523基因的序列分析  30
  2.3 结果  30-32
    2.3.1 hp0523基因的克隆  30-31
    2.3.2 蛋白的理化特性预测分析  31
    2.3.3 hp0523基因在不同菌株间的比较  31
    2.3.4 蛋白质功能预测与二级结构分析  31-32
    2.3.5 GenBank登陆号  32
  2.4 讨论  32-34
第三章 幽门螺杆菌hp0523基因在大肠杆菌中表达、产物的纯化及其活性的鉴定  34-46
  3.1 材料  34-38
    3.1.1 菌株和载体  34-35
    3.1.2 主要试剂  35
    3.1.3 主要溶液  35-37
    3.1.4 主要仪器  37-38
  3.2 方法  38-41
    3.2.1 原核表达载体pET-28a-hp0523的构建  38
    3.2.2 蛋白诱导表达和鉴定  38-39
    3.2.3 目的蛋白可溶性分析  39
    3.2.4 目的蛋白的纯化  39
    3.2.5 蛋白的复性  39
    3.2.6 细菌肽聚糖的提取  39-40
    3.2.7 溶菌斑点实验  40
    3.2.8 凝胶酶谱分析  40
    3.2.9 细菌浊度实验  40-41
  3.3 结果  41-44
    3.3.1 原核表达载体pET-28a-hp0523的构建  41
    3.3.2 目的蛋白的表达与纯化  41-42
    3.3.3 溶菌活性的鉴定  42-43
    3.3.4 肽聚糖水解活性的鉴定  43
    3.3.5 水解底物的特异性检测  43-44
    3.3.6 不同pH条件下的酶活性变化  44
  3.4 讨论  44-46
第四章 幽门螺杆菌hp0523基因的缺失及其对CagA蛋白转运能力的影响  46-54
  4.1 材料  46-47
    4.1.1 细胞、菌株和载体  46
    4.1.2 主要试剂  46
    4.1.3 主要溶液  46-47
    4.1.4 主要仪器  47
  4.2 方法  47-49
    4.2.1 细菌和细胞的培养  47
    4.2.2 自杀质粒同源臂片段的扩增  47-48
    4.2.3 自杀质粒pBlueKM40/△hp0523::Km~r的构建  48
    4.2.4 hp0523基因缺失株的构建  48-49
    4.2.5 hp0523基因缺失株的鉴定  49
    4.2.6 CagA蛋白转运实验  49
    4.2.7 CagA蛋白表达水平  49
  4.3 结果  49-51
    4.3.1 hp0523基因缺失自杀质粒的构建  49-50
    4.3.2 hp0523基因缺失株的鉴定  50
    4.3.3 hp0523基因缺失前后对CagA蛋白转运能力的影响  50-51
    4.3.4 hp0523基因缺失前后对CagA蛋白表达的影响  51
  4.4 讨论  51-54
第五章 主要结论和展望  54-56
  5.1 主要结论  54
  5.2 展望  54-56
致谢  56-57
参考文献  57-64
攻读硕士期间发表论文和参加课题  64

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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