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黑色素瘤激活因子CXCL1与不同亚型IL-8在恶性卵巢肿瘤组织中的表达研究

作　者: 周怡
导　师: 李力
学　校: 广西医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: CXCL1蛋白 不同亚型IL-8蛋白 原核表达载体 MALDI-TOF-MS 激光显微捕获 免疫磁珠 卵巢癌早期诊断
分类号: R737.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 157次
引　用: 1次
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内容摘要


第一章卵巢恶性肿瘤蛋白组学研究现况(文献综述)卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,由于临床症状隐匿,缺乏有效的早期诊断方法,超过70%的患者就诊时已为晚期,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。肿瘤标志物CA125特异性不强,存在假阳性,不能单独用于卵巢癌筛查。而高通量的蛋白组学技术和生物信息学工具将为卵巢癌生物标志物的大规模快速筛查提供有力武器。黑色素瘤激活因子CXCL1(GRO-a)和IL-8(CXCL8)同属于趋化因子,多项研究表明,黑色素瘤激活因子CXCL1和IL-8对卵巢恶性肿瘤的发生、信号转导过程等有着重要的影响。本实验室先期发现CXCL1和不同亚型的IL-8蛋白(1-77aa)、(6-77aa)和(9-77aa)可能在卵巢癌的早期诊断中起重要作用。本课题为探讨综合判断CXCL1蛋白和不同亚型IL-8的表达能否成为卵巢癌早期诊断的新标志而努力,旨在推动卵巢癌的诊断由应用单一肿瘤标志物发展成为应用蛋白质谱的改变来进行综合判断。第二章CXCL1和不同亚型IL-8蛋白的原核表达目的:通过基因工程技术,扩增出编码CXCL1和不同亚型IL-8成熟肽的基因全长,构建其原核表达载体,表达CXCL1和不同亚型IL-8蛋白。方法:选取浆液性卵巢癌组织作为模板提取人卵巢癌组织总mRNA,逆转录成cDNA,利用PCR技术扩增编码CXCL1和不同亚型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)的成熟肽基因。将扩增产物与原核表达载体PET SUMO连接,构建原核表达载体并测序鉴定重组子。结果:成功构建了CXCL1和不同亚型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)的原核表达载体,重组子经测序验证同源性均达100%。将其转化至表达菌株表达融合蛋白,后者经镍柱纯化后,通过SUMO蛋白酶酶解去除SUMO载体蛋白,MALDI-TOF-MS的结果证明获得了CXCL1、IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)的成熟蛋白。结论:通过成功表达小分子量的CXCL1和不同亚型IL-8的成熟肽,为课题的深入研究打下了坚实的试验基础。原核表达的产物可用作质谱检测的标准品或作为高纯度的抗原用于制备相应的单克隆抗体等。第三章激光显微捕获联合免疫磁珠的技术在质谱检测中的应用及CXCL1和不同亚型IL-8蛋白在恶性卵巢肿瘤组织中的表达研究目的:建立一种质谱专一性检测卵巢组织上皮细胞中CXCL1及不同亚型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)表达的技术方法,以进一步探讨CXCL1及不同亚型IL-8在恶性卵巢肿瘤组织中的表达及其与卵巢恶性肿瘤早期诊断之间的关系。方法:利用激光显微捕获分别收集卵巢恶性肿瘤、良性肿瘤、正常卵巢组织中的卵巢上皮细胞,裂解细胞蛋白后,通过包被有CXCL1或IL-8抗体的免疫磁珠特异结合上述细胞蛋白裂解液中的CXCL1或各亚型的IL-8蛋白,经微量层析柱浓缩免疫磁珠洗脱液后,采用MALDI-TOF-MS检测免疫磁珠洗脱液中的CXCL1或各亚型的IL-8。结果:①经激光显微捕获能精确收集到卵巢恶性肿瘤及其良性或正常对照组织中的卵巢上皮细胞,收集到的细胞数量级达10~5-10~6。MALDI-TOF-MS检测结果显示免疫磁珠与上述组织细胞裂解液中的CXCL1及不同亚型IL-8结合情况良好,且各亚型的IL-8经质谱可得到较好的区分。②CXCL1在卵巢恶性组织细胞中高表达(阳性率为90%),在良性及正常对照中不表达。③IL-8(1-77aa)在卵巢恶性、良性、正常组织细胞中均有表达(阳性率分别为40%,100%和66.67%);IL-8(6-77aa)在卵巢恶性组织细胞中表达(阳性率为30%),在良性及正常对照中不表达;IL-8(9-77aa)在所有组织细胞样本中均未见表达。结论:①成功建立了利用质谱专一性研究卵巢组织上皮细胞中CXCL1及不同亚型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)表达的技术方法。②CXCL1由恶性卵巢上皮细胞分泌,且可能是较好的潜在肿瘤标志物。③卵巢恶性、良性肿瘤患者和正常人的组织、血清中IL-8蛋白的表达亚型不同,综合判断不同亚型IL-8蛋白的表达在卵巢恶性肿瘤的早期诊断研究中可能有重要价值。

全文目录


主要英文缩写  8-11
摘要  11-13
ABSTRACT  13-16
第一章 卵巢恶性肿瘤蛋白组学研究现况(文献综述)  16-76
  1.卵巢恶性肿瘤概述  16-35
    1.1 卵巢恶性肿瘤的发病率和可能的致病因素  17-19
      1.1.1 卵巢恶性肿瘤的发病率  17-18
      1.1.2 卵巢恶性肿瘤可能的致病因素  18-19
    1.2 卵巢恶性肿瘤的诊断  19-29
      1.2.1 卵巢恶性肿瘤的诊断模式:  19-27
        1.2.1.1 影像学诊断  19-20
        1.2.1.2 肿瘤标记物检测  20-26
          1.2.1.2.1 肿瘤胚胎抗原性标志物  20-21
          1.2.1.2.2 糖类标志物  21-23
          1.2.1.2.3 激素类标志物  23
          1.2.1.2.4 酶和同工酶类标志物  23-24
          1.2.1.2.5 蛋白质类标志物  24
          1.2.1.2.6 癌基因产物类标志物  24-26
        1.2.1.3 细胞学检查  26
        1.2.1.4 腹腔镜检查  26-27
      1.2.2 卵巢恶性肿瘤的鉴别诊断模式:  27
      1.2.3 卵巢恶性肿瘤诊断与鉴别诊断模式存在的问题:  27-29
    1.3 卵巢恶性肿瘤治疗的模式及存在的问题  29-35
      1.3.1 手术治疗  29-31
        1.3.1.1 全面确定分期探查手术  29
        1.3.1.2 再分期手术  29-30
        1.3.1.3 肿瘤细胞减灭术  30
        1.3.1.4 中间性或间隔性肿瘤细胞减灭  30
        1.3.1.5 二次探查手术  30-31
        1.3.1.6 二次肿瘤细胞减灭术  31
      1.3.2 化疗  31-34
        1.3.2.1 早期卵巢癌的化疗  31-32
        1.3.2.2 晚期卵巢癌的化疗  32
        1.3.2.3 复发卵巢癌的化疗  32-33
        1.3.2.4 腹腔化疗  33
        1.3.2.5 新辅助化疗  33
        1.3.2.6 超大剂量化疗和外周血干细胞移植  33-34
      1.3.3 卵巢恶性肿瘤基因治疗  34
      1.3.4 卵巢恶性肿瘤治疗存在的问题  34-35
  2.蛋白组学的概念及主要研究方法  35-54
    2.1 蛋白组学的概念  35-37
    2.2 蛋白质组学的研究内容及主要的技术路线  37-40
      2.2.1 蛋白质组学的研究内容  37-38
        2.2.1.1 蛋白质鉴定  37
        2.2.1.2 翻译后修饰  37
        2.2.1.3 蛋白质功能确定  37-38
      2.2.2 蛋白质组学研究的技术路线  38-40
    2.3 蛋白组学的常用技术及原理  40-54
      2.3.1 2-DE技术  40-42
      2.3.2 MS技术  42-44
      2.3.3 微阵列技术  44-47
      2.3.4 生物信息学技术  47-49
      2.3.5 其它技术  49-54
        2.3.5.1 质谱显像技术  49-50
        2.3.5.2 多维液相色谱  50-51
        2.3.5.3 核素标签色谱  51
        2.3.5.4 蛋白质芯片技术  51-52
        2.3.5.5 化学喷墨印迹  52-53
        2.3.5.6 酵母双杂交技术  53-54
  3.蛋白组学在卵巢肿瘤研究中的应用  54-61
    3.1 在卵巢癌诊断标记物筛选和鉴定中的应用现况  54-56
    3.2 在卵巢癌治疗靶点筛选鉴定和药物开发中的应用现况  56-57
    3.3 在卵巢癌发病机理研究中的应用现况  57-60
      3.3.1 探讨信号传导通路机理  58-59
      3.3.2 探讨浸润转移机制  59-60
      3.3.3 探讨多药耐药机理  60
    3.4 蛋白质组学的现状和展望  60-61
  4.CXCL1与卵巢肿瘤相关性研究  61-67
    4.1 CXCL1的发现、分子结构和主要的生物学功能  62-65
      4.1.1 CXCL1的发现  62
      4.1.2 CXCL1的分子结构  62-63
      4.1.3 CXCL1的生物学功能  63-65
        4.1.3.1 刺激细胞生长和迁移  63-64
        4.1.3.2 促进伤口愈合和促血管生成  64
        4.1.3.3 CXCL1与病毒感染  64-65
    4.2 CXCL1与恶性肿瘤的关糸研究现况  65-66
    4.3 CXCL1与卵巢恶性肿瘤的关系及分子机理  66-67
  5.IL-8及亚型与卵巢肿瘤相关性研究  67-76
    5.1 IL-8的分子结构、各亚型间的区别和主要的生物学功能  67-71
      5.1.1 IL-8的分子结构  67-68
      5.1.2 IL-8各亚型间的区别  68-70
      5.1.3 IL-8主要的生物学功能  70-71
        5.1.3.1 抑制凋亡  70
        5.1.3.2 调节细胞外基质  70
        5.1.3.3 自分泌作用  70-71
        5.1.3.4 参与肿瘤血管形成  71
        5.1.3.5 调节基质金属蛋白酶  71
    5.2 IL-8及亚型与恶性肿瘤的关糸研究现况  71-72
    5.3 IL-8及亚型与卵巢恶性肿瘤的关糸及分子机理  72-76
第二章 CXCL1和不同亚型IL-8的原核表达  76-121
  1.前言  76
  2.材料与方法  76-106
    2.1 材料  76-83
      2.1.1 标本  76
      2.1.2 质粒与菌株  76-78
      2.1.3 主要试剂及配制  78-82
        2.1.3.1 试剂  78-79
        2.1.3.2 试剂的配制方法  79-82
      2.1.4 仪器  82
      2.1.5 器具处理  82-83
    2.2 引物设计与合成  83-85
    2.3 实验方法  85-106
      2.3.1 卵巢癌组织总RNA提取  85-87
      2.3.2 cDNA第一链的合成  87-89
      2.3.3 基因全长的扩增  89-90
      2.3.4 PCR产物的纯化与回收  90-91
      2.3.5 连接反应  91-92
      2.3.6 转化Mach1~(TM)-T1~R感受态细胞  92-93
      2.3.7 挑取阳性克隆  93
      2.3.8 质粒DNA的快速提取  93-94
      2.3.9 转化子鉴定  94-95
      2.3.10 菌液的长期保存  95
      2.3.11 表达重组子  95-98
        2.3.11.1 转化BL21(DE3)One Shot(?)感受态细胞  95
        2.3.11.2 IPTG诱导蛋白表达  95-97
        2.3.11.3 SDS-PAGE分析表达产物  97-98
      2.3.12 融合蛋白的纯化  98-100
        2.3.12.1 扩大蛋白表达量  98
        2.3.12.2 融合蛋白提取  98-99
        2.3.12.3 镍螯合柱亲和层析法纯化表达菌中的融合蛋白  99-100
        2.3.12.4 SDS-PAGE检测纯化效果  100
      2.3.13 MALDI-TOF-MS鉴定融合蛋白  100-103
      2.3.14 SUMO酶切融合蛋白  103-104
        2.3.14.1 除盐  103
        2.3.14.2 Lowry法(微孔板法)测蛋白浓度:  103-104
        2.3.14.3 SUMO酶解  104
      2.3.15 纯化酶解后蛋白  104
      2.3.16 MALDI-TOF-MS鉴定酶解后CXCL1和不同亚型IL-8成熟蛋白  104-106
  3.结果  106-119
    3.1 卵巢癌组织总RNA1%琼脂糖凝胶电泳结果  106
    3.2 cDNA质量检测  106-107
    3.3 目的基因扩增结果  107
    3.4 PCR鉴定连接产物  107-108
    3.5 重组子测序结果  108-112
    3.6 SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达纯化  112
    3.7 MALDI-TOF-MS鉴定融合蛋白  112-117
    3.8 Lowry法测定蛋白浓度  117
    3.9 MALDI-TOF-MS鉴定原核表达终产物的获得  117-119
  4.讨论  119-121
第三章 激光显微捕获联合免疫磁珠的技术在质谱检测中的应用及CXCL1和不同亚型IL-8蛋白在恶性卵巢肿瘤组织中的表达研究  121-156
  1.前言  121-122
  2.材料与方法  122-133
    2.1 材料  122-126
      2.1.1 主要试剂及配制  122-123
        2.1.1.1 试剂  122-123
        2.1.1.2 试剂的配制方法  123
      2.1.2 仪器  123-124
      2.1.3 器具  124
      2.1.4 器具处理  124
      2.1.5 组织标本  124-126
    2.2 方法  126-133
      2.2.1 冰冻组织切片  126
      2.2.2 TBO染色  126-127
      2.2.3 激光显微捕获  127-128
      2.2.4 裂解LCM捕获细胞  128
      2.2.5 免疫磁珠与LCM捕获细胞蛋白裂解液结合  128-131
      2.2.6 微量层析柱的应用  131
      2.2.7 MALDI-TOF-MS建立检测用标准曲线及样品检测  131-133
  3.结果  133-151
    3.1 激光显微捕获卵巢上皮细胞  133-134
    3.2 CXCL1、不同亚型IL-8蛋白的标准曲线建立  134-141
    3.3 CXCL1、不同亚型IL-8蛋白的表达研究  141-151
      3.3.1 CXCL1的表达  141-146
        3.3.1.1 质谱检测免疫磁珠结合样品中的CXCL1  141-145
        3.3.1.2 CXCL1在卵巢恶性肿瘤中的表达分析  145-146
      3.3.2 不同亚型IL-8的表达  146-151
        3.3.2.1 质谱检测免疫磁珠结合样品中的不同亚型的IL-8  146-149
        3.3.2.2 不同亚型IL-8在卵巢恶性肿瘤中的表达分析  149-151
  4.讨论  151-156
    4.1 建立质谱联合激光显微捕获和免疫磁珠检测CXCL1及不同亚型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)在卵巢恶性肿瘤上皮细胞中表达的技术方法  151-152
    4.2 CXCL1蛋白在卵巢恶性肿瘤组织中的表达研究  152-153
    4.3 不同亚型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)在卵巢恶性肿瘤组织中的表达研究  153-156
全文小节  156-157
参考文献  157-174
致谢  174

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