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抗枣疯病相关基因的克隆与分析

作　者: 乔勇
导　师: 赵锦；刘孟军
学　校: 河北农业大学
专　业: 植物学
关键词: 枣枣疯病 AFLP SON-PCR 差异表达片断
分类号: S665.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 86次
引　用: 1次
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内容摘要

枣(Ziziphus jujuba Mill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus Mill.)植物,是我国特有的宝贵种质资源和重要的特色果树。枣疯病由植原体(phytoplasma)引起,是枣树上最严重的毁灭性病害之一。利用抗病种质资源,借助分子生物学手段和方法克隆抗病基因,对开展分子育种具有重要意义。前期研究中本课题组已经发现在骏枣品种中存在对枣疯病的抗病和感病品系。本研究利用AFLP和SON-PCR技术,以骏枣抗病和感病品系为试材,进行了基因组水平上的差异表达分析,并利用获得的差异片段进行了侧翼序列的延伸。主要结果如下:1.通过骏枣抗病和感病品系的AFLP分析,获得了11条差异片段。应用56对选择性引物对对骏枣的枣疯病抗性和感病品系进行AFLP分析,最终利用筛选出的10对特异性较好的引物进行扩增和差异片段的筛选,最终确定并分析了了11条差异片段,其中6条是与抗病相关的,5条是与感病相关的。2.建立了一套适合于枣未知基因侧翼序列扩增的SON-PCR技术体系。本试验应用传统的SON-PCR技术体系不能获得理想的试验结果,经在原有体系基础上进行改进和优化,即将第二、三轮嵌套扩增由原来的一步扩增都分为两步进行。主要是将第二、三轮的嵌套扩增中的线性延伸单独列出,从而增加了反应的特异性和高效性。试验证明改进后的SON-PCR体系能够有效地得到目的差异条带,获得理想结果。3.利用本试验建立的改进SON-PCR技术将一条抗性相关片段(165bp)延伸到了1119bp。利用改进的SON-PCR技术将抗性相关片段R1(165bp)上游延伸了390bp,下游延伸了564bp,拼接后长度为1119bp。利用NCBI数据库,进行了Blast比对分析,此序列与白杨中编码SAUR家族蛋白(SAUR3)的mRNA序列有80%的相似性;通过开放阅读框的寻找,结果显示此序列含有一个不完整的开放阅读框,多个起始密码子,不含终止密码子,此部分开放阅读框编码161个氨基酸,其中在第24个氨基酸和第121个氨基酸之间存在SAUR(Small auxin-up RNAs)超家族蛋白的保守序列。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-18
  1.1 枣疯病的研究现状  10-11
  1.2 分子标记技术及植物基因的差异表达研究  11-13
  1.3 AFLP 技术及其在基因组DNA 差异表达研究中的应用  13-14
  1.4 利用PCR 技术扩增已知片段的侧翼序列进行扩增  14-16
    1.4.1 反向PCR(InversePCR，I-PCR)  14-15
    1.4.2 锅柄PCR (Panhandle-PCR, P-PCR)  15
    1.4.3 热不对称交错PCR (Thermal Asymmetric Interlaced PCR, TAIL-PCR)  15-16
    1.4.4 单寡聚核苷酸嵌套PCR (single oligonucleotide nested PCR, SON-PCR)  16
  1.5 SON-PCR 技术及其应用  16-17
  1.6 本课题的立题依据及前景分析  17-18
2 材料与方法  18-30
  2.1 材料  18-21
    2.1.1 试验材料  18-19
    2.1.2 试验仪器  19-20
    2.1.3 试验化学试剂  20
    2.1.4 试验所用引物  20-21
  2.2 试验方法  21-30
    2.2.1 供试材料基因组总DNA 的提取和纯化  21-22
    2.2.2 DNA 的检测  22
    2.2.3 AFLP 分析  22-25
    2.2.4 差异片段的回收及二次PCR 扩增、测序  25-26
    2.2.5 利用SON-PCR 扩增已知序列的侧翼片段  26-30
3 结果与分析  30-41
  3.1 骏枣不同品系基因组DNA 的提取  30-31
  3.2 骏枣不同品系的AFLP 分析  31-35
    3.2.1 AFLP 选择性引物的筛选  31
    3.2.2 骏枣不同品系的AFLP 扩增结果  31-33
    3.2.3 抗病、感病相关差异条带的筛选和测序  33-35
  3.3 抗病相关片段的侧翼序列扩增及分析  35-41
    3.3.1 SON-PCR 体系优化  35-36
    3.3.2 SON-PCR 扩增结果及生物信息学分析  36-41
4 讨论  41-44
  4.1 材料的选择和基因组DNA 的提取  41
  4.2 AFLP 技术在抗枣疯病基因差异表达研究中的应用  41-42
  4.3 SON-PCR 体系的改善  42-43
  4.4 抗枣疯病相关片段的分析  43
  4.5 下一步工作计划  43-44
5 结论  44-45
参考文献  45-49
附录  49-51
在读期间发表的学术论文  51-52
作者简历  52-53
致谢  53

抗枣疯病相关基因的克隆与分析

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