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口蹄疫病毒3B非结构蛋白单克隆抗体的制备及应用

作　者: 李永亮
导　师: 刘在新
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒 3B非结构蛋白单克隆抗体单抗液相阻断ELISA 疫苗质量控制
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

利用原核表达并纯化的O型口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)非结构蛋白(non-structural protein,NSP)3B,通过鉴定后免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法亚克隆,获得了6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E5、4B1、4D7、4E11、7B2和8B11。鉴定结果显示,4B1和4E11细胞分泌IgG1,其余4株细胞分泌IgG2b;纯化后6株腹水单抗的纯度达93%,对3B蛋白的ELISA滴度均可达到1:100000以上。ELISA结果显示,六株单抗均能与口蹄疫病毒3B、3AB和3ABC非结构蛋白反应,不与FMDV病毒其他蛋白反应,是抗FMDV 3B非结构蛋白特异性单克隆抗体。相加ELISA试验显示,6株单抗识别相同的抗原表位。杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存6个月后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。利用原核表达纯化的3B蛋白和4B1单抗,分别作为包被抗原和检测抗体,建立了快速检测样品中3B非结构蛋白含量的单抗液相阻断ELISA方法,通过绘制标准曲线并建立回归方程,计算出该方法对病毒培养液样品中3B蛋白的最小检出量为5ng/mL。利用该方法检测了不同批次的FMDV细胞培养病毒抗原样本,结果显示,不同批次的样品中3B蛋白含量有差异,而且灭活前后3B蛋白的含量也有差异。该方法的建立为FMD疫苗抗原质量控制提供了可供参考的质控方法。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-11
第一章绪论  11-21
  1.1 研究背景、目的及意义  11-13
  1.2 国内外研究现状  13-21
    1.2.1 单抗技术研究现状  13-14
    1.2.2 单抗的临床应用  14-17
    1.2.3 口蹄疫病毒单克隆抗体研究现状  17-20
    1.2.4 我国目前单克隆抗体前景与面临的问题  20-21
第二章口蹄疫病毒3B 非结构蛋白单克隆抗体的制备与鉴定  21-44
  2.1 材料  21-23
    2.1.1 实验动物  21
    2.1.2 骨髓瘤细胞  21
    2.1.3 相关试剂与耗材  21-22
    2.1.4 主要仪器  22-23
  2.2 方法  23-34
    2.2.1 抗原的制备  23-26
    2.2.2 筛选方法的建立  26-27
    2.2.3 小鼠免疫及效价测定  27
    2.2.4 融合  27-29
    2.2.5 ELISA 筛选  29
    2.2.6 亚克隆  29-30
    2.2.7 制备腹水  30
    2.2.8 腹水抗体纯化  30-31
    2.2.9 单克隆抗体的鉴定  31-33
    2.2.10 杂交瘤细胞株的鉴定  33-34
  2.3 结果  34-40
    2.3.1 3B 蛋白的表达、纯化与鉴定  34
    2.3.2 最适抗原包被浓度和酶标二抗工作浓度的确定  34-35
    2.3.3 免疫小鼠抗体效价  35
    2.3.4 细胞融合结果及亚克隆  35-36
    2.3.5 6 株腹水单抗制备及抗体纯化结果  36
    2.3.6 单克隆抗体鉴定  36-40
  2.4 小结与讨论  40-44
    2.4.1 抗原的制备  40-41
    2.4.2 小鼠免疫  41
    2.4.3 建立筛选方法  41-42
    2.4.4 细胞融合和筛选  42-43
    2.4.5 阳性克隆的筛选  43
    2.4.6 杂交瘤细胞株的鉴定  43-44
第三章利用单抗定量检测病毒培养液样品中3B 蛋白方法的建立  44-55
  3.1 材料  44-45
    3.1.1 病毒培养液与BHK-21 细胞培养上清  44
    3.1.2 单克隆抗体  44
    3.1.3 检测用抗原  44-45
    3.1.4 相关试剂与溶液  45
    3.1.5 主要仪器  45
  3.2 方法  45-48
    3.2.1 检测 3B 含量的单抗液相阻断 ELISA 方法的建立  45-47
    3.2.2 病毒液样品灭活处理  47
    3.2.3 亲和层析方法结合病毒培养液中的38 蛋白  47-48
    3.2.4 鉴定洗脱下来的38 蛋白  48
    3.2.5 液相阻断 ELISA 方法的操作步骤  48
    3.2.6 方法的敏感性与特异性鉴定  48
  3.3 结果  48-53
    3.3.1 ELISA 方法建立的条件  48-50
    3.3.2 阻断ELISA 测定MAb 对不同浓度38 蛋白标准品的抑制效价  50-51
    3.3.3 曲线的拟合以及推导回归方程  51-52
    3.3.4 偶联单克隆抗体的结果  52
    3.3.5 鉴定洗脱下来的38 蛋白的结果  52
    3.3.6 方法的敏感性与特异性鉴定结果  52-53
  3.4 小结与讨论  53-55
    3.4.1 ELISA 方法的建立  53
    3.4.2 检测结果  53-54
    3.4.3 检测方法的评价  54-55
第四章全文结论  55-56
参考文献  56-61
致谢  61-62
作者简介  62-63
导师简介  63

口蹄疫病毒3B非结构蛋白单克隆抗体的制备及应用

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