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猪MMP-2和TIMP-2基因特征与功能分析

作　者: 黄宏刚
导　师: 李奎
学　校: 中国农业科学院
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 MMP-2 TIMP-2 序列特征基因组结构启动子染色体定位组织表达谱关联分析免疫性状
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

基质金属蛋白酶-2(MMP-2),又称明胶酶A (gelatinase-A)或IV型胶原酶(type IV collagenase),是基质金属蛋白酶家族重要成员,它能够降解明胶和IV型胶原以调节组织重构活动过程。然而近期研究表明它在炎症反应和免疫反应中发挥重要作用,它可以影响在炎症反应过程中所召集的免疫细胞的清除以缓解消除炎症反应,同时,在许多人和动物模型的炎症和免疫疾病过程中,MMP-2的表达都有不同程度的升高。TIMP-2是MMP2生物活性的主要抑制因子,同时,TIMP-2是参与激活proMMP-2形成具有生物学活性MMP-2的必要因子。鉴于MMP-2和TIMP-2在医学疾病研究中的重要作用意义,本研究通过对猪MMP-2和TIMP-2两基因进行特征和功能分析,旨在为后期以猪为医学动物模型和猪的遗传育种相关研究提供参考信息。与现有人和小鼠MMP-2基因信息相比较,猪MMP-2信息极为有限,在本研究中,通过生物信息学检索比较分析,设计引物,我们克隆获得猪MMP-2基因的5′上游序列,3′下游序列和其它缺失的基因组序列,获得猪MMP-2完整基因组序列信息,对猪MMP-2基因组结构和启动子区域比较分析发现其与人MMP-2存在较高相似性。应用法国农业科学院-明尼苏达大学的辐射杂种克隆板(IMpRH panel)将猪MMP-2基因定位于猪6号染色体6p14–p15,与微卫星标记SW1108 (53cR, LOD score 7.59)紧密连锁。实时定量PCR检测表明猪MMP-2基因表达在不同组织存在显著差异,在猪睾丸、子宫组织高度表达,在其他组织表达水平相对较低。同时我们在猪MMP-2基因组上检测到15个多态性位点,然后选择其中第12外显子上的SNP AcyI和第4内含子上的23bp indel MspI进行进一步研究。应用RFLP-PCR技术,我们针对这两位点在不同品种猪群体中检测了不同等位基因基因分布频率,并在纯种长白资源群体中进行了基因型性状关联分析。关联分析数据表明,SNP AcyI与初生仔猪(0天)白细胞计数(WBC) (P=0.0079)和出生17天仔猪的猪瘟病毒抗体水平(CSFV-AB) (P=0.0461)显著相关,而indel MspI则与出生17天仔猪的红细胞平均血红蛋白量(MCH)极显著相关(P<0.0001)。将人TIMP-2 mRNA全长序列在猪ESTs数据库中检索获得同源性较高的ESTs,用电子克隆结合RT-PCR方法克隆获得包含完整CDS区的猪TIMP-2基因cDNA序列。所得cDNA序列全长790 bp,包括663bp的完整开放阅读框,编码221个氨基酸。多序列比对和系统进化分析表明,该基因编码蛋白质与人(97%)、大鼠(97%)、小鼠(97%)等物种TIMP-2蛋白质具有较高的同源性。蛋白质序列预测分析发现猪TIMP-2氨基酸序列理论等电点(pI)为7.65,分子量(MW)为24.5kDa,它包括27aa的前导序列和194aa的成熟肽段,其前导序列比其他物种多出一个亮氨酸(Leu)。结构功能预测发现其具有一个在种间高度保守NTR_TIMP结构域和N端VIRAK保守序列,序列中存在的12个半胱氨酸(Cys)可以形成6对二硫键结构。表达谱分析表明TIMP-2基因在猪的多个组织和时期中的表达量存在较大差异,在睾丸、垂体、胃、大肠、卵巢、子宫和90天胚胎骨骼肌中高表达;而在心脏、小肠、脑、肝脏、成年猪骨骼肌表达量极低;在肾脏、胸腺、脾、甲状腺、33天胚胎中中度表达。结果表明该基因在发生组织发育和重构活动相对较为活跃的组织器官和时期表达水平较高,亦符合其固有生物学功能。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
英文缩略表  10-14
第一章文献综述  14-29
  1.1 基质金属蛋白酶（MMPs）概述  14-15
  1.2 MMPs 结构特征及其分类  15-16
  1.3 MMPs 活性的调控  16-19
  1.4 MMPs 的生物学功能  19-24
  1.5 MMPs 的启动子区  24
  1.6 待分离基因研究进展  24-27
    1.6.1 MMP-2 基因研究进展  24-25
    1.6.2 TIMP-2 基因研究进展  25-27
  本研究的目的和意义  27-29
第二章猪MMP-2 基因特征及其与免疫性状关联分析  29-55
  2.1 实验材料  29-33
    2.1.1 实验动物  29-30
    2.1.2 IMpRH 辐射杂种板  30
    2.1.3 组织样品  30-31
    2.1.4 载体和菌株  31
    2.1.5 主要试剂  31
    2.1.6 主要试剂的配制  31-32
    2.1.7 主要仪器  32-33
    2.1.8 主要分子生物学软件  33
    2.1.9 主要数据库和生物信息学网站  33
  2.2 实验方法  33-41
    2.2.1 候选基因基因组全长序列的分离方法  33-36
    2.2.2 基因染色体定位的RH 法  36-37
    2.2.3 目的基因表达谱分析  37-38
    2.2.4 启动子特征分析  38
    2.2.5 猪基因的多态性检测  38-39
    2.2.6 实验猪资源群体性状测定  39
    2.2.7 数据统计分析  39-41
  2.3 实验结果  41-51
    2.3.1 猪MMP-2 基因基因组序列结构特征分析  41-43
    2.3.2 猪MMP-2 基因启动子特征分析  43-45
    2.3.3 猪MMP-2 基因染色体定位  45-46
    2.3.4 猪MMP-2 基因组织表达谱  46-48
    2.3.5 遗传多态性位点检测，不同品种间遗传多样性分析  48-50
    2.3.6 关联分析  50-51
  2.4 讨论  51-55
第三章猪TIMP-2 基因克隆，序列特征和表达分析  55-64
  3.1 实验材料  55-56
    3.1.1 DNA 样品和cDNA 模板  55-56
  3.2 实验方法  56-58
    3.2.1 引物设计  56
    3.2.2 PCR 扩增反应  56
    3.2.3 不同组织和发育时期时期表达谱分析  56-57
    3.2.4 克隆测序  57
    3.2.5 序列分析和结构预测  57-58
  3.3 结果与分析  58-62
    3.3.1 猪TIMP-2 基因CDS 克隆及序列分析  58-60
    3.3.2 TIMP-2 蛋白质结构功能预测  60-61
    3.3.3 组织表达谱分析  61-62
  3.4 讨论  62-64
第四章结论  64-66
参考文献  66-74
附录  74-81
致谢  81-82
个人简历  82

猪MMP-2和TIMP-2基因特征与功能分析

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