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β-兴奋剂多残留快速检测技术的研究

作　者: 张亚峰
导　师: 刘聚祥；王建平
学　校: 河北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 沙丁胺醇克伦特罗多克隆抗体 ELISA 胶体金
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

β₂-兴奋剂（β₂ -adrenergic agonist, BAA）属于拟肾上腺素类药物,由于其具有促进动物生长、提高瘦肉率的作用曾被作为饲料添加剂应用于动物养殖业中。然而BAA长期作为饲料添加剂后,它潜在的危害就逐渐被人们认识,会严重危害消费者的身体健康,因此,建立BAA残留检测的方法成为关系食品安全的亟待解决的问题。本文分别采用混合酸酐法和碳化二亚胺法合成了沙丁胺醇（SAL）免疫抗原和包被抗原,SAL与牛血清白蛋白（BSA）的偶联比分别为12:1和6:1,与卵清蛋白（OVA）的偶联比分别为9:1和4:1。用免疫抗原免疫兔子后,所得抗血清经饱和硫酸铵法沉淀和DEAE-纤维素阴离子交换层析纯化,得到纯度较高的抗SAL抗体IgG。该抗体对SAL有较高的特异性,IC50为6.004 ng/mL,同时对沙丁胺醇的同系物克伦特罗（CL）有85.44%的交叉反应率,IC50为7.027 ng/mL,但对其他β-兴奋剂类药物无交叉反应性。以该抗体为基础建立了同时检测沙丁胺醇和克伦特罗的间接竞争ELISA方法。方阵滴定法确定包被抗原和抗体的最适工作浓度分别为4万倍和8万倍稀释。以抑制率为纵坐标,分别以SAL和CL浓度的负对数为横坐标绘制标准曲线,针对SAL和CL的线性方程分别为Y=-20.868X+96.359和Y=-20.77X+94.722。该ELISA方法对SAL和CL的最低检测限分别为0.219ng/mL和0.253ng/mL。在空白猪肉和猪尿中按1-50ng/g（mL）的浓度添加SAL和CL后,对SAL的添加回收率为72.2%-87.8%,变异系数分别为4.6%-11.7%,对CL的回收率为79.9% -97.4%,变异系数为1.3%-13.5%。以该沙丁胺醇抗体为基础,结合免疫胶体金技术,制备了快速检测沙丁胺醇和克伦特罗的金标试纸条。试纸条直接浸入猪尿中即可在5min内用肉眼对结果进行判定,阳性结果为一条红线,阴性结果为两条红线。试纸条对猪尿中沙丁胺醇和克伦特罗的最小检出限分别为2.0ng/mL和2.5ng/mL。本研究以沙丁胺醇抗体为基础建立了一种快速,灵敏的ELISA方法,并研制了一种简便、快速的沙丁胺醇免疫胶体金检测试纸条,以期能更加快速有效的监控养殖业中沙丁胺醇和克伦特罗的非法使用,保障动物源性食品安全。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-12
第一章引言  12-22
  1 β_2-兴奋剂概述  12-14
    1.1 理化性质  12-13
    1.2 药理作用  13-14
  2 β_2-兴奋剂残留检测的国内外研究  14-20
    2.1 残留特性  14-15
    2.2 β_2-兴奋剂的免疫检测方法  15-17
    2.3 人工抗原的制备方法  17-19
    2.4 胶体金快速检测技术  19-20
  3 研究目的和意义  20-22
第二章沙丁胺醇抗原抗体的制备及鉴定  22-32
  1 试验材料  22-23
    1.1 试剂和药品  22
    1.2 仪器与设备  22
    1.3 溶液的制备  22-23
    1.4 试验动物  23
  2 试验方法  23-27
    2.1 沙丁胺醇免疫抗原的制备  23-24
      2.1.1 混合酸酐法  23
      2.1.2 碳化二亚胺法  23-24
    2.2 免疫抗原的鉴定  24
      2.2.1 偶联物的浓度测定  24
      2.2.2 偶联物的鉴定  24
    2.3 包被抗原的制备方法  24
    2.4 抗体的制备  24-26
      2.4.1 抗体的制备  24-25
      2.4.2 抗体的纯化  25-26
    2.5 抗体效价测定  26-27
      2.5.1 琼脂双向双扩散法确定抗体效价  26
      2.5.2 用间接 ELISA 法检测血清效价  26-27
    2.6 抗体检测  27
      2.6.1 特异性检测  27
      2.6.2 交叉反应性检测  27
  3 结果与分析  27-30
    3.1 抗原鉴定  27-29
      3.1.1 紫外分光光度法鉴定  27-28
      3.1.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果  28
      3.1.3 半抗原与载体蛋白的分子结合比  28-29
    3.2 抗体效价  29-30
      3.2.1 琼脂双向双扩散试验  29
      3.2.2 间接ELISA 检测抗体效价  29-30
    3.3 抗体特异性和交叉反应性检测  30
  4 讨论  30-32
    4.1 半抗原与载体蛋白的偶联  30
    4.2 动物免疫  30-31
    4.3 交叉反应性  31-32
第三章间接竞争 ELISA 检测方法的建立  32-36
  1 试验材料  32
  2 试验方法  32-34
    2.1 特异性检测  32
      2.1.1 抗SAL 抗体对SAL 的特异性检测  32
      2.1.2 抗SAL 抗体对CL 的特异性检测  32
    2.2 标准曲线的制作  32-33
    2.3 样品提取方法  33
    2.4 添加回收率的测定  33-34
      2.4.1 猪肉中回收率测定  33
      2.4.2 猪尿中回收率测定  33
      2.4.3 回收率的计算  33-34
  3 结果分析  34-35
    3.1 抗体的特异性检测  34
    3.2 检测 SAL（CL）的标准曲线的建立  34
    3.3 添加回收率的测定  34-35
  4 讨论  35-36
第四章沙丁胺醇胶体金免疫层析检测法的建立  36-46
  1 试验材料  36
  2 试验方法  36-40
    2.1 胶体金的制备  36-37
      2.1.1 玻璃器皿的准备  36
      2.1.2 制备胶体金溶液  36
      2.1.3 胶体金的质量鉴定  36-37
    2.2 胶体金探针的制备  37-38
      2.2.1 待标记蛋白溶液的制备  37
      2.2.2 胶体金标记抗体最适蛋白量的测定  37
      2.2.3 胶体金标记蛋白的最适pH 值确定  37
      2.2.4 金标抗体的制备  37-38
      2.2.5 金标抗体的质量鉴定  38
    2.3 试纸条的制备  38-40
      2.3.1 硝酸纤维素膜的选择  38
      2.3.2 试纸条组装  38-39
      2.3.3 试纸条的优化  39
      2.3.4 试纸条灵敏度检测  39
      2.3.5 对其他 BAA 类药物的检测  39-40
      2.3.6 重复性和稳定性  40
  3 结果分析  40-46
    3.1 胶体金制备  40-41
      3.1.1 胶体金颗粒  40
      3.1.2 胶体金的质量鉴定  40-41
    3.2 胶体金探针的制备  41-43
      3.2.1 胶体金标记蛋白的最适pH 值确定  41-42
      3.2.2 胶体金标记抗体最适蛋白量的测定  42
      3.2.3 金标抗体的制备  42-43
    3.3 试纸条的制备  43-45
      3.3.1 硝酸纤维素膜的选择  43
      3.3.2 检测限  43-44
      3.3.3 对其他 BAA 类药物的检测  44
      3.3.4 重复性和稳定性  44-45
    4 讨论  45-46
结论  46-47
参考文献  47-52
攻读学位论文期间发表论文情况  52-53
作者简介  53-54
致谢  54

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