学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

牛结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆表达及ELISA检测方法的初步建立

作　者: 王爽
导　师: 郝永清
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛分枝杆菌 Ag85B 克隆表达 PPD ELISA
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 89次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

牛结核病主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人兽共患的慢性、消耗性传染病。牛结核病原菌可以感染人和多种动物,其中,牛是最易感的动物特别是奶牛。人类与牛的关系较为密切,据调查10%以上的人结核病是由牛分枝杆菌引起的,因此牛分枝杆菌是人结核病的重要病原,所以掌握和应用高敏感、高准确率的牛结核检疫方法是防止患结核病牛的牛分枝杆菌感染人类的重要手段之一。本试验根据GenBank公布的牛分枝杆菌AF2122/97(检索号NC002945)株的Ag85B基因序列设计引物,以牛分枝杆菌ValleeⅢ基因组DNA为模板利用PCR方法扩增牛分枝杆菌Ag85B基因,把Ag85B基因克隆于pET-32a(+)原核表达载体上,经测序和EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定,获得阳性重组质粒pET32-Ag85B,将阳性重组质粒pET32-Ag85B转化到BL21感受态细胞中用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western-Blot检测分析,表明蛋白成功表达,而且能够与牛结核阳性血清反应,经His.bind柱子纯化后获得纯度较高的Ag85B蛋白。同时本试验以纯化的Ag85B蛋白为包被抗原,初步建立Ag85B-ELISA,对其包被浓度、血清稀释度、封闭液、及底物作用时间等方面进行选择和优化,而且对Ag85B-ELISA与PPD-ELISA方法在符合性、敏感性和特异性方面进行比较,结果显示Ag85B-ELISA特异性高于PPD-ELISA,而PPD-ELISA的敏感性高于Ag85B-ELISA,由于实验动物较少二者的符合性差别不明显。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
1 前言  9-14
  1.1 牛结核病的简介  9-11
    1.1.1 流行病学  9
    1.1.2 病原  9-11
  1.2 牛结核病的诊断  11-13
    1.2.1 细菌学方法  11-12
    1.2.2 提纯结核菌素皮内变态反应试验  12
    1.2.3 IFN-Γ诊断法  12
    1.2.4 ELISA 诊断方法  12
    1.2.5 PCR 诊断  12-13
  1.3 酶联免疫吸附技术简介  13-14
  1.4 实验的目的和意义  14
2 实验一  14-33
  2.1 实验材料  14-17
    2.1.1 载体及菌种  14
    2.1.2 试剂与工具酶  14
    2.1.3 试验主要仪器  14
    2.1.4 AG85B 蛋白克隆表达所用培养基与试剂  14-17
  2.2 实验方法  17-27
    2.2.1 AG85B 基因的克隆  18-21
      2.2.1.1 牛分枝杆菌基因组DNA 的提取  18
      2.2.1.2 引物设计  18
      2.2.1.3 目的片段的扩增  18-21
    2.2.2 AG85B 基因表达质粒的载体构建  21-24
    2.2.3 融合蛋白的表达  24-25
    2.2.4 菌体的SDS-PAGE 分析  25
    2.2.5 表达产物存在形式的鉴定  25-26
    2.2.6 表达产物AG85B 蛋白的生物学活性鉴定  26
      2.2.6.1 菌体的SDS-PAGE 电泳  26
      2.2.6.2 表达产物WESTERN-BLOT 检测  26
    2.2.7 重组蛋白表达最佳诱导条件的确定  26-27
      2.2.7.1 重组蛋白表达最佳IPTG 浓度的确定  26
      2.2.7.2 重组蛋白表达最佳诱导时间的确定  26-27
    2.2.8 蛋白纯化  27
      2.2.8.1 包涵体蛋白的分离  27
      2.2.8.2 包涵体的溶解  27
      2.2.8.3 包涵体的复性与目的蛋白的纯化  27
      2.2.8.4 蛋白浓度的测定  27
  2.3 实验结果  27-32
    2.3.1 目的基因的扩增与克隆  27-28
    2.3.2 重组质粒双酶切鉴定  28
    2.3.3 重组表达载体双酶切鉴定  28-29
    2.3.4 测序结果  29-31
    2.3.5 表达蛋白的SDS-PAGE 和WESTERN-BLOT 分析  31-32
  2.4 讨论  32-33
3 实验二 AG85B-ELISA 方法的初步建立  33-37
  3.1 实验材料  33-34
    3.1.1 载体和菌种  33
    3.1.2 实验试剂及酶  33
    3.1.3 试验及主要应用的仪器  33
    3.1.4 实验用血清  33
    3.1.5 ELISA 所用试剂及配置  33-34
  3.2 实验方法  34-37
    3.2.1 间接ELISA 操作程序  34-35
      3.2.1.1 酶标板的包被  34
      3.2.1.2 封闭  34
      3.2.1.3 加样  34-35
      3.2.1.4 加入酶标二抗  35
      3.2.1.5 显色  35
    3.2.2 牛提纯结核菌素（PPD）皮内变态反应  35
      3.2.2.1 PPD 皮试注射部位及术前处理  35
      3.2.2.2 皮内注射及采血  35
      3.2.2.3 术后观察  35
      3.2.2.4 判定标准  35
    3.2.3 PPD-ELISA 条件的摸索  35-36
      3.2.3.1 PPD 一ELISA 抗原包被浓度确定  35-36
      3.2.3.2 血清稀释度及抗原抗体最佳作用时间的选择  36
      3.2.3.3 封闭液及封闭时间的选择  36
      3.2.3.4 酶标二抗作用时间的选择  36
      3.2.3.5 底物反应时间的选择  36
    3.2.4 AG85B-ELISA 方法的建立  36-37
      3.2.4.1 抗原AG85B 蛋白包被浓度的确定  36
      3.2.4.2 血清稀释度及抗原抗体最佳作用时间的选择  36-37
      3.2.4.3 封闭液及封闭时间的选择  37
      3.2.4.4 酶标二抗稀释液浓度及作用时间的选择  37
      3.2.4.5 底物反应时间的选择  37
      3.2.4.6 符合性试验  37
      3.2.4.7 敏感性试验  37
      3.2.4.8 特异性试验  37
4 实验结果与分析  37-42
  4.1 PPD 皮内变态反应结果  37
  4.2 PPD-ELISA 最佳条件的确立  37-40
    4.2.1 PPD-ELISA 包被浓度的确定  37-38
    4.2.2 血清稀释度及抗原抗体最佳作用时间的确定  38
    4.2.3 封闭液的选择  38-39
    4.2.4 酶标二抗作用时间的选择  39
    4.2.5 底物反应时间的选择  39-40
    4.2.6 PPD-ELISA 改进后检测程序  40
  4.3 AG85B-ELISA 方法的建立  40
  4.4 符合性试验结果  40
  4.5 敏感性试验  40-41
  4.6 特异性试验  41
  4.7 讨论  41-42
5 结论  42-43
致谢  43-44
参考文献  44-48
作者简介  48

牛结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆表达及ELISA检测方法的初步建立

内容摘要

全文目录

相似论文