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体细胞克隆小鼠胚胎的试验研究

作　者: 彭礼繁
导　师: 罗光彬
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 小鼠体细胞核移植卵丘细胞成纤维细胞电融合囊胚
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本研究以昆明小鼠和615小鼠为实验动物,在初步建立了体细胞核移植技术操作程序的基础上,探讨了影响体细胞核移植技术的关键性因素,为以后的转基因小鼠研究奠定了试验基础。试验结果如下:1.探讨了注射HCG后不同取卵时间对重构胚体外发育的影响。结果显示,注射HCG后第11h、12h、13h、14h的受体卵子成熟率显著高于注射HCG后第9h、10、15h、16h、17h、18h、19h和20h等取卵时间组（P<0.05）;只在注射HCG后第11h、12h、13h、14h、15h取卵时间组中,观察到有重构囊胚的出现;且在注射HCG后第11h和12h取卵时,重构囊胚率显著高于第13h、14h、15h取卵时间组（P<0.05）。2.探讨了不同化学试剂和电刺激对重构胚体外发育的影响。结果显示,在单一激活中,SrCl₂激活组的重构胚体外发育率显著高于钙离子载体A23187组、酒精组和离子霉素组（P<0.05）;且只在SrCl₂激活组中获得重构桑葚胚。在复合激活中,Sr6D+SrCB激活组在重构胚体外发育率上略高于SrCB组、Sr6D组和SrCB+Sr6D组,但差异不显著（P>0.05）。3.探讨了不同培养液对重构胚体外发育的影响。结果显示,只在mCZB^*培养液中获得重构囊胚。4.探讨了不同蔗糖浓度对体外去核时间和重构胚体外发育的影响。结果显示,随着显微操作液中蔗糖浓度的增加,每个卵子的平均显微操作时间也在不断下降。在各蔗糖浓度的显微操作液中,去核率均达到100%。不加蔗糖的显微操作液中的重构胚融合率略高于加入蔗糖的显微操作液,但差异不显著（P>0.05）。显微操作液中蔗糖的加入与否对重构胚的体外发育率影响并不大,均能够有效地支持重构胚发育到囊胚期。但是,4%和5%蔗糖浓度的显微操作液对重构胚的体外发育率影响较大,其后期的体外发育率均显著低于1%、2%、3%蔗糖浓度组（P<0.05）。5.探讨了不同电融合参数对重构胚体外发育的影响。结果显示,脉冲场强200V/mm,脉冲时程60μs,脉冲次数1次时,重构胚的体外发育率最好。6.探讨了不同供体细胞保存温度对重构胚体外发育的影响。结果显示,室温组在融合率和胚胎发育率上均显著高于低温组、高温组和温度变化组（P>0.05）。低温组和高温组最多支持重构胚发育到2～4细胞期,温度变化组不利于重构胚的体外发育。7.探讨了不同融合温度对重构胚体外发育的影响。结果显示,25℃的融合率显著高于37℃的融合率（P<0.05）。但这两组在胚胎发育率上差异不显著（P>0.05）。8.探讨了不同供体细胞构建重构胚的体外发育情况。结果显示,第一组将141个卵进行了显微操作后,有98个卵丘细胞重构胚存活,最后得到15.3%的重构囊胚。第二组将89个卵进行了显微操作后,有65个成纤维细胞重构胚存活,最后得到4.6%的重构囊胚。9.探讨了重构胚移植到受体鼠后的发育情况。结果显示,将数枚重构胚各自移入到A、B、C、D、E 5只受体鼠中。只在B号和C号的受体鼠中,检测到着床点。本试验结论如下:（1）PMSG、HCG均为5.0IU时,昆明系小鼠的卵母细胞体内成熟率最高。（2）注射HCG后第10h取卵,去核效果最佳。（3）注射HCG后第11h和12h取卵,重构胚体外发育最好。（4）Sr6D+SrCB激活组为重构胚体外发育的最佳激活剂。（5）mCZB^*为重构胚体外发育的最佳培养液。（6）显微操作液中蔗糖的加入与否对重构胚的体外发育率影响很小,3%蔗糖浓度有利于缩短卵子体外暴露的时间,可以使卵核更加明显,使去核的操作工程更快更省时。（7）脉冲场强200V/mm,脉冲时程60gs,脉冲次数1次为重构胚体外发育的最佳电融合参数。（8）对供体细胞进行室温保存有利于重构胚体外发育。（9）25℃的融合温度,有利于重构胚的融合率及其体外发育率。（10）卵丘细胞重构胚在体外发育情况比胎儿成纤维细胞重构胚好。（11）本试验移植了数枚重构胚到受体鼠的单侧输卵管中,19～20天后各组均未见有怀孕迹象,对其进行剖腹产,在两组中检测到着床点。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-13
前言  13-24
  1 小鼠体细胞克隆的研究方法  13-19
    1.1 胞质受体的选择  13-14
    1.2 供体细胞的选择  14-16
    1.3 克隆胚胎的构建方法  16-17
    1.4 克隆胚胎的激活  17-19
  2 促进核移植重编程的方法  19-21
    2.1 选择G_0/G_1期的供体细胞  19-20
    2.2 改变供体细胞的化学遗传组分  20
    2.3 曲古霉素A的应用  20-21
  3 异种克隆的研究进展  21-22
  4 治疗性克隆的研究进展  22
  5 体细胞克隆技术在转基因中的应用  22-24
材料与方法  24-35
  1 材料  24-27
    1.1 实验动物  24
    1.2 主要仪器设备  24-25
    1.3 药品与试剂  25-26
    1.4 耗材  26-27
  2 方法  27-32
    2.1 试剂配制  27-29
    2.2 核移植操作的过程  29-30
    2.3 电融合  30-31
    2.4 重构胚的激活  31
    2.5 重构胚的体外培养和观察  31
    2.6 结扎雄鼠制备  31
    2.7 假孕雌鼠制备  31-32
    2.8 重构胚移植  32
  3 试验设计  32-34
  4 统计分析  34-35
结果与分析  35-44
  1 超排激素剂量对两种品系小鼠卵母细胞体内成熟率的影响  35
  2 注射HCG后不同取卵时间对卵核与第一极体位置及卵周隙变化的影响  35-36
  3 注射HCG后不同取卵时间对重构胚体外发育的影响  36-37
  4 不同化学试剂和电刺激对重构胚体外发育的影响  37-38
  5 不同培养液对重构胚体外发育的影响  38-39
  6 不同蔗糖浓度对体外去核时间和重构胚体外发育的影响  39-40
  7 不同电融合参数对重构胚体外发育的影响  40-41
  8 不同供体细胞保存温度对重构胚体外发育的影响  41-42
  9 不同融合温度对重构胚体外发育的影响  42
  10 不同供体细胞构建重构胚体外发育情况  42-43
  11 重构胚移植到受体鼠后的发育情况  43-44
讨论  44-59
  1 超排激素剂量对两种品系小鼠卵母细胞体内成熟率的影响  44-45
  2 注射HCG后不同取卵时间对卵核与第一极体位置及卵周隙变化的影响  45-46
  3 注射HCG后不同取卵时间对重构胚体外发育的影响  46
  4 不同化学试剂和电刺激对重构胚体外发育的影响  46-48
  5 不同培养液对重构胚体外发育的影响  48-51
  6 不同蔗糖浓度对体外去核时间和重构胚体外发育的影响  51-52
  7 不同电融合参数对重构胚体外发育的影响  52-54
  8 不同供体细胞保存温度对重构胚体外发育的影响  54-55
  9 不同融合温度对重构胚体外发育的影响  55
  10 不同供体细胞构建重构胚的体外发育情况  55-57
  11 重构胚移植到受体鼠后的发育情况  57-59
结论  59-60
参考文献  60-69
缩略语表  69-70
附录  70-74
论文图片  74-77
致谢  77-78
攻读硕士学位期间发表的学术论文  78

体细胞克隆小鼠胚胎的试验研究

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