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N端无半胱氨酸断裂蛋白质内含子的构建及蛋白质N端标记的应用

作　者: 李佳
导　师: 孟清；刘相钦
学　校: 东华大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蛋白质N端标记 N端无半胱氨酸蛋白质内含子无半胱氨酸蛋白质内含子蛋白质反式剪接 TM系统
分类号: TQ463.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

蛋白质是细胞功能的主要执行者。在许多情况下,一个细胞功能的实现是多个蛋白质分子相互作用的结果。近年来,随着蛋白质标记技术的不断发展与成熟,对蛋白质的研究进入了一个高速发展的阶段。对它们的研究主要包括“体内”和“体外”两个方向。体外研究的重点是纯化后的蛋白质,将它们置于可控制的环境中,以期获得它们的功能信息；而体内研究实验着重于蛋白质在细胞或者整个组织中的活性作用,从而可以了解蛋白质发挥功能的场所和相应的调节机制。在体内或者体外的蛋白质工程和蛋白质修饰有利于帮助探究蛋白质的生物功能和结构功能。目前对蛋白质进行标记的方法主要有各种化学方法和利用蛋白质内含子的反式剪接进行的标记。前者大多数相对简单易行,可是存在许多不足之处,如特异性不强,化学标签容易干扰被标记蛋白的活性,蛋白浓度要求较高等；后者是一项新兴的蛋白质标记技术,它虽然克服了化学标记的不足可是目前仍有融合蛋白不稳定、溶解性较差、活性低和通用性差等急需解决的问题。本文在蛋白质反式剪接的基础上另辟蹊径,寻找内部半胱氨酸较少的内含子,对活性较高的内含子我们利用定点突变、搭桥PCR等方法,构建断裂蛋白质内含子,获得活性较高的N末端(整个intein内部)无半胱氨酸的内含子,并通过SDS-PAGE, Western Blot等方法检测蛋白质内含子的剪接活性,然后利用实验室的TM系统检测蛋白质内含子作为标记手段的应用潜质。最后选择合适的蛋白进行N端特异性标记。本课题选取蛋白质内含子TerNdse-2、TX-S1、HaVol Pol、Msm DnaB-1、Arsp FB24和PP-PhiEL ORF40进行蛋白质N端标记的研究。其中Msm DnaB和Arsp FB24为3型蛋白质内含子,其余均为常见的1型蛋白质内含子。TerNdse、TX-S1 (C1/S)、HaVol Po1、Msm DnaB-1和Arsp FB24的一位氨基酸分别为丝氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸,这些intein内部半胱氨酸也非常少,有利于定点突变和后续标记的应用。首先对这些蛋白质内含子的原始剪接活性进行检测,在体内pMTerNdse-2有微弱接活性,pMTX-S1 (C1/S)有较高的剪接活性(本实验室已研究,体内和体外均由较高的剪接活性),pMHP的剪接活性为100%,pMMD(C1突变成S后)有微弱的剪接活性,pMAF没有任何剪接活性。接着对pMTerNdse-2、pMTX-S1 (C1/S)和pMHP进行氨基酸定点突变,将其内部的所有半胱氨酸通过搭桥PCR突变成丝氨酸,同时将pMMD内部的C1恢复。通过Western Blot检测它们的剪接活性。pMTerNdse-2、pMTX-S1 (C1/S)和pMHP在半胱氨酸完全突变后没有任何剪接活性,pMMD有非常高的剪接活性。对pMHP,将其内部的四个半胱氨酸分别突变成丝氨酸,我们发现第二个半胱氨酸可以决定其剪接活性,利用定点突变的方法选择其侧链基团相似的氨基酸进行替换,首先选择苏氨酸和甘氨酸进行替换,幸运的获得了两个内部有剪接活性的无半胱氨酸的HP突变体、pMHPG和pMHPT,为荻得一种通用性的标记intein奠定了基础。通过和实验室的蛋白质内含子进行比对等确定S1、S0和S11三个断裂位点,构建pMTerNdse-2、pMMD、pMHP、pMHPG和pMHPT对应的S1、S0和S11体内断裂蛋白质内含子。通过Western Blot检测其剪接活性,pMTerNdse-2、pMHP和pMHPG三个断裂intein没有剪接活性,pMHPT-S1有较高的剪接活性；pMMD-SO有100%的剪接活性。通过SWISS MODLE建模,Protean比对等,从新选择了其它断裂位点,pMHP、pMHPG和pMHPT选择了10个新的断裂位点F1-F10,pMMD重新选择了5个断裂位点F1-F5。通过Western Blot检测其体内剪接活性,结果显示,pMHP-F2和F8有较高的剪接活性；pMHPT只有F2有剪接活性；pMMD只有F4有非常高的剪接活性。选择pMHP-F2、pMHP-F8、pMHPT-S1、pMHPT-F2、pMMD-S0、pMMD-F4和pMTX-S1 (C1/S)几个蛋白质内含子,构建含有N端前体蛋白或C端前体蛋白相应序列的表达质粒,麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)与IN组成的融合蛋白为N端前体蛋白：IC与硫氧还蛋白(thioredoxin, T)组成的融合蛋白为C端前体蛋白。利用N端前体蛋白带有的MBP标签可以与Amylose resin特异性结合,C端前体蛋白带有的6×组氨酸标签可以与Ni-NTA resin特异性结合,纯化得到用于后续体外反应所需的N端前体蛋白和C端前体蛋白。将纯化的N端前体蛋白与C端前体蛋白在摩尔比为1：1的条件下进行反应,通过Western印迹检测剪接反应的活性,结果表明,断裂蛋白质内含子pMTX-S1(C1/S)和pMMD-SO有部分剪接活性,其余蛋白质内含子的体外剪接活性还需要进一步实验验证。对有剪接活性的体外断裂蛋白质内含子,我们选择TXS1在TM系统检测其蛋白质N端标记的应用。将TX-S1N构建到含有SUMO的PEDHC表达载体中,体外纯化TX-S1N和TX-S1C蛋白,TX-S1N与巯基染料以1：5的比例反应4小时,通过透析袋透析掉未反应的染料,接着SUM0酶与L-X-S1N反应1小时,切除SUMO蛋白,将L-TX-S1和TX-S1 C在体外剪接Buffer内反应3小时,SDS-PAGE检测,利用波长346-442纳米的紫外观察拍照。本课题不仅是对前人研究的补充,同时还克服了化学合成和蛋白质标记的不足之处,实现了蛋白质的N-端特异性位点标记。为实现可控的、特异的、对目标蛋白影响小的对目标蛋白的标记及实际应用奠定了基础。同时,我们发现了一种非常有意思的现象：pMHP和pMMD内部一个非保守区的半胱氨酸竟然可以决定蛋白质内含子的活性,目前没有相关文献的报道,其化学和分子生物学机理值得继续研究,相信是蛋白质内含子剪接理论知识的很好补充。另外,获得了两个活性非常高的内部无半胱氨酸的蛋白质内含子突变体,虽然现在没有获得有活性的体外断裂蛋白质内含子,但是我们会继续研究,希望获得活性较高的多个断裂蛋白质内含子,这样不仅为N端标记提供了选择的蛋白质内含子,同时也为蛋白质的C端标记或两端标记都提供了通用的蛋白质内含子和一种新的蛋白质标记途径。

全文目录

摘要  5-8
ABSTRACT  8-13
第一章绪论  13-28
  1.1 引言  13
  1.2 化学标记  13-14
  1.3 蛋白质内含子的发现  14-15
  1.4 蛋白质内含子的结构和分类  15-18
  1.5 蛋白质内含子的剪接机制  18-23
  1.6 蛋白质内含子的应用  23-26
  1.7 本课题研究的目的、内容和意义  26-28
第二章实验材料、基本技术和设计方案  28-50
  2.1 实验材料和仪器  28-41
  2.2 实验基本技术  41-47
  2.3 实验设计方案  47-50
第三章实验过程  50-91
  3.1 合适蛋白质内含子的选择、基因改造、基因序列的获得及克隆的构建  50-55
  3.2 N端无半胱氨酸和无半胱氨酸蛋白质内含子的构建及剪接活性的检测  55-68
  3.3 断裂位点的选择、内部断裂蛋白质内含子的构建及剪接活性的检测  68-77
  3.4 体外断裂蛋白质内含子表达质粒的构建  77-83
  3.5 前体蛋白质的纯化  83-86
  3.6 断裂蛋白质内含子体外剪接反应和剪接条件的优化  86-88
  3.7 利用模式蛋白T进行N-端标记应用的检测  88-91
第四章实验结果  91-131
  4.1 合适蛋白质内含子的选择、基因改造、基因序列的获得及克隆的构建  91-97
  4.2 N端无半胱氨酸和无半胱氨酸蛋白质内含子的构建及剪接活性的检测  97-105
  4.3 断裂位点的选择、内部断裂蛋白质内含子的构建及剪接活性的检测  105-117
  4.4 体外断裂蛋白质内含子表达质粒的构建  117-118
  4.5 前体蛋白质的纯化  118-124
  4.6 断裂蛋白质内含子体外剪接反应和剪接条件的优化  124-127
  4.7 利用模式蛋白T进行N-端标记应用的检测  127-131
第五章结论  131-134
  5.1 结论  131-132
  5.2 创新点  132
  5.3 展望  132-134
参考文献  134-139
硕士期间发表论文和参加科研情况说明  139-140
致谢  140

N端无半胱氨酸断裂蛋白质内含子的构建及蛋白质N端标记的应用

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