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Jagged-1信号诱导小鼠骨髓来源树突状细胞的分化和成熟

作　者: 方志远
导　师: 邢飞跃
学　校: 暨南大学
专　业: 免疫学
关键词: Jagged-1 树突状细胞 T细胞 细胞因子 NICD Hes-1 Deltex-1 小鼠
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:探讨可溶性Jagged-1/Fc嵌合蛋白(Jagged-1)对重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞(DCs)的分化和成熟的影响。方法:建立体外诱导小鼠骨髓来源DCs的模型,显微镜下观察rmGM-CSF和rmIL-4协同诱导的小鼠骨髓DCs形态学变化的影响;荧光标记单克隆抗体染色技术结合流式细胞仪检测Jagged-1对小鼠骨髓DCs分化标记CD11c及DCs成熟标记MHC-Ⅱ、CD86、CD80和CD40表达的影响;通过westernblot检测Jagged-1、γ分泌酶抑制剂DAPT(Theγ-secretase inhibitor N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-1-alany1]-S-phenylg lycinetbutyl ester,DAPT)、细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、酵母聚糖A(Zymosan A)对DCs的Jagged-1-Notch下游通路NICD、Hes-1、Deltex-1表达的影响;通过Luminex蛋白液相芯片技术和ELISA检测经上述不同处理的DCs和淋巴结细胞培养体系上清中白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素12(IL-12)、干扰素γ(IFN-γ)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平。结果:rmGM-CSF和rmIL-4处理2天骨髓来源细胞形成明显大小不等的半贴壁集落,5天后集落开始变小,细胞表面出现小突起,细胞逐渐增大,但是培养后期不同处理组细胞形态稍有不同。Jagged-1诱导的细胞具有典型成熟DCs的形态特征,培养第7天时,Jagged-1组CD11c高表达细胞明显增多,与LPS组无显著差异,CD86、CD80、CD40和MHC-Ⅱ高表达细胞的阳性率也均高于对照组,与LPS、Zymosan A组相似;DCs在加入Jagged-1后1h NICD(Notch Intracellular Domain)开始表达,6h达高峰,持续到24h,之后表达有所下降,而Hes-1、Deltex-1在加入Jagged-1后3h才开始有较高表达,24h达高峰,持续到48h,DAPT对Jagged-1-Notch通路有显著的抑制作用,LPS、Zymosan A组NICD、Hes-1、Deltex-1蛋白表达不同时段均较低。骨髓来源细胞在培养第6天用不同药物处理后,LPS和Zymosan A能普遍上调各种细胞因子的表达,但对TGF-β影响较小,而Jagged-1能大量上调IL-4、IL-10的表达,并抑制TNF-α表达,对其他细胞因子影响较小,DAPT对Jagged-1诱导的IL-12和TNF-α表达抑制有逆转作用,但对其他细胞因子表达影响较小。淋巴细胞经过不同浓度的Jagged-1的处理4天后,各种细胞因子表现出不同的表达趋势。与对照组比较,Jagged-1组除TGF-β、IL-6外各种细胞因子表达普遍下调,TNF-α、IFN-γ、IL-4水平显著降低,LPS、Zymosan A组与Jagged-1组相比TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12显著增加,且LPS组TGF-β显著减少。混合淋巴细胞反应结果显示Jagged-1减弱了DCs对同种异基因淋巴细胞的激活能力。结论:Jagged-1能通过NICD激活Notch通路下游因子Hes-1、Deltex-1的表达,诱导骨髓来源DCs的分化和成熟,促进IL-4、IL-10等Th2型细胞因子表达并抑制IFN-γ、IL-12和TNF-α等Th1型细胞因子表达。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-10
前言  10-16
材料与方法  16-26
  1 实验动物  16
  2 主要试剂  16-17
  3 主要仪器  17
  4 主要溶液的配制  17-19
    4.1 磷酸盐缓冲液(PBS)溶液成份  17-18
    4.2 红细胞裂解液  18
    4.3 鞘液(FCM)  18
    4.4 电泳缓冲液  18
    4.5 转移缓冲液  18
    4.6 10%十二烷基硫酸钠SDS溶液  18-19
    4.7 分离胶缓冲液  19
    4.8 浓缩胶缓冲  19
    4.9 封闭液(10X TBS)  19
  5 小鼠淋巴细胞的制备  19
  6 小鼠骨髓细胞的制备  19-20
  7 小鼠骨髓来源DCs的诱导  20
  8 小鼠骨髓来源DCs分化和成熟的检测  20-21
  9 小鼠骨髓来源DCs的体外分化诱导和MLR  21
  10 细胞因子检测  21-23
    10.1 ELISA检测  21-23
    10.2 Luminex~(TM)100检测  23
  11 Western Blot蛋白检测(免疫印迹法)  23-25
    11.1 样品制备  23
    11.2 蛋白定量  23-24
    11.3 电泳分离  24
    11.4 转膜  24-25
    11.5 封闭及抗体杂交显色  25
  12 统计学处理  25-26
结果  26-38
  1 Jagged-1对DCs形态的影响  26-27
  2 Jagged-1对DCs分化的影响  27-28
  3 Jagged-1对DCs成熟的影响  28-31
  4 Jagged-1对DCs分泌细胞因子的影响  31-33
  5 Jagged-1对DCs Notch通路活化的影响  33-36
    5.1 Jagged-1处理对骨髓源性DCs中NICD表达的影响  33-34
    5.2 Jagged-1处理对骨髓源性DCs中Deltex-1表达的影响  34-35
    5.3 Jagged-1处理对骨髓源性DCs中Hes-1表达的影响  35-36
  6 Jagged-1对DCs刺激淋巴细胞增殖能力影响  36-38
讨论  38-49
参考文献  49-54
在学期间发表论文  54-55
致谢  55-56
英文缩略词表  56

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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