学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

稳定表达软骨调节素Ⅰ的大鼠MSCs细胞株的建立

作　者: 周连仲
导　师: 翟立杰
学　校: 大连医科大学
专　业: 耳鼻咽喉科学
关键词: 软骨调节素-Ⅰ MSCs 软骨 生物因子
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 0次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


目的:构建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ表达载体,稳定转染大鼠骨髓间充质干细胞,并验证其在MSCs中的上调表达,建立ChM-Ⅰ稳定上调表达的MSCs细胞株,为进一步开展ChM-Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化,构建组织工程软骨相关研究打下基础。方法:1.用Trizol法提取大鼠软骨组织总RNA,根据ChM-Ⅰ基因序列(序列号:AF051425)设计特异引物,上游引物为:5’ GCAGACAAGCTTATGACAGAGAACTCGGACA 3’ ,下游引物为:5’ GCAGACGCGGCCGCTTACACCATGCCCAAGATG 3’,通过PCR获取ChM-Ⅰ目的基因,分别将ChM-Ⅰ目的基因的PCR产物和pcDNA3.1 (+)质粒双酶切,并将两者定向连接,构建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒,转化感受态细菌,挑取阳性单克隆并扩增,酶切鉴定阳性克隆,并对插入的ChM-Ⅰ片段进行测序。2.密度梯度离心法获得大鼠MSCs,传代培养并扩增。使用流式细胞技术检测细胞表面抗原;对大鼠MSCs进行成脂及成骨诱导培养,检测所获得MSCs的潜在分化能力。3.脂质体法将质粒转染进大鼠MSCs。实验分三组:实验组(转染pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒);对照组(转染pcDNA3.1(+)质粒);空白组。通过预实验,确定大鼠MSCs的最佳G418筛选浓度为200ug/ml。转染复合体作用6小时后,更换完全培养基,48小时后加入200ug/mlG418筛选培养基,使用筛选培养基持续传代培养并扩增实验组和对照组细胞,以获得稳定转染质粒的大鼠MSCs。4.取稳转后连续培养三代的大鼠MSCs提取总RNA和蛋白质,使用RT-PCR和Western blot分别在RNA和蛋白质水平上检测ChM-Ⅰ在各组大鼠MSCs细胞株内的转录和表达,鉴定所筛选的大鼠MSCs细胞株中ChM-Ⅰ的上调表达及其稳定性。结果:1.对阳性克隆鉴定及测序和序列分析对比,结果显示与ChM-Ⅰ基因长度相符,序列无误,且读码框正确。2.单细胞悬液接种48小时后换液,倒置显微镜观察并拍照,可于培养皿底部见到呈梭形或三角形的贴壁细胞,培养11-13天后培养皿底部细胞密度达到90%以上。细胞传代,在6小时内可达80%以上贴壁,细胞生长速度加快,可见细胞呈成纤维细胞样生长,折光性较强,可呈鱼群样生长。流式细胞仪鉴定结果:MSCs阳性表面抗原CD90、CD29的表达率分别为99.79%、98.41%;MSCs阴性表面抗原CD45、CD11b/c的表达率分别为2.77%、2.51%。成脂诱导2周后,油红O染色,脂滴为橙红色;成骨诱导3周后,茜素红染色,镜下显现为红色斑片。3.转染复合体作用6小时后,可见大量MSCs胞质内出现折光性强的小泡,提示阳离子脂质体已结合质粒进入MSCs。48小时后加入200ug/mlG418筛选培养基5天后空白组出现少量细胞漂浮死亡,实验组和对照组也可见少量细胞死亡。7天后空白组出现大量死亡,14天后空白组细胞全部死亡,两个转染组大约有10%的细胞存活,转染组细胞不再死亡,开始增殖,生长速度逐渐加快。传代后,细胞生长旺盛,排列密集整齐,呈编织状旋涡状。4. RT-PCR结果:采用ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值作为评定指标,实验组、对照组和空白组ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值的平均值分别为1.0817±0.2233、0.3601±0.1260、0.3687±0.0086;实验组与对照组和空白组间具有统计学意义P<0.05,对照组与空白组间无统计学意义P> 0.05。Western blot结果:采用ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值作为评定指标,实验组、对照组和空白组ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值的平均值分别为0.9867±0.0204、0.4155±0.0206、0.3751±0.0081;实验组与对照组和空白组间具有统计学意义(P<0.05),对照组与空白组间无统计学意义(P> 0.05)。结果提示:实验组中的ChM-Ⅰ在mRNA水平和蛋白水平上的表达均明显高于对照组和空白组。结论:成功将pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒转染到大鼠骨髓间充质干细胞中,经过含G418的筛选培养基稳定筛选,最终建立ChM-Ⅰ稳定上调表达的MSCs细胞株,为进一步开展ChM-Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化,构建组织工程软骨相关研究打下基础。

全文目录


中文摘要  6-8英文摘要  8-11前言  11-12材料与方法  12-20结果  20-25讨论  25-28结论  28-29参考文献  29-32综述  32-41  参考文献  38-41附录  41-42致谢  42

相似论文

  1. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对鸡软骨细胞增殖、分化及凋亡的影响,S858.31
  2. 新型非病毒基因转染体系的构建及其在骨髓间充质干细胞基因重组中的应用,R346
  3. 茶黄素与TGF-β3对兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞增殖和诱导分化地影响,R329
  4. 牛膝总皂甙对兔早期骨关节炎及PI3K/AKT通路的影响,R285.5
  5. 应用脂肪干细胞与丝素蛋白和壳聚糖支架材料共同构建细胞—支架复合物的实验研究,R329
  6. VEGF诱导成神经分化的间充质干细胞定向迁移研究,R329
  7. 液质法测定贝类中软骨藻酸及毒素在小鼠体内分布和代谢的研究,R114
  8. 动态压应力与PTHrP对体外培养大鼠前软骨干细胞生物学特性的影响,R329
  9. 抗软骨藻酸单克隆抗体直接竞争ELISA方法的建立及试剂盒的组装,X835
  10. 人滑膜间充质干细胞/壳聚糖—明胶复合支架的相容性研究,R318.08
  11. 钝性损伤后关节软骨的变化,R873
  12. 功能负荷改变对兔髁突软骨中BMP-2表达的影响,R782.6
  13. 补肾壮骨胶囊治疗膝OA的临床疗效观察及对兔膝OA软骨细胞凋亡的影响,R285
  14. 健膝壮骨方对大鼠骨性关节炎软骨细胞凋亡及其调控基因P53、Bcl-2表达作用的影响,R285.5
  15. 3D-TSE（SPACE）序列在骨关节系统临床应用研究,R684
  16. 腰椎软骨终板细胞凋亡与椎间盘退变的关系研究,R681.53
  17. 面向银行业务的高可用性构建技术研究,TP311.52
  18. BMCs膜片与种植体复合共培养促进2型糖尿病大鼠骨结合,R783
  19. microRNA-9通过Notch-1信号通路促进小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,R329
  20. 转化生长因子β1及白介素1β对终板软骨细胞作用的实验研究,R681.5

中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
© 2012 www.xueweilunwen.com