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核桃外果皮抑制人宫颈癌HeLa细胞活性成分筛选

作　者: 张瑞廷
导　师: 傅力
学　校: 新疆农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 核桃外果皮人宫须癌HeLa细胞活性成分细胞凋亡含量测定
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文对新疆核桃外果皮抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖的有效部位及活性成分进行筛选。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法从核桃外果皮石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、氯仿萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位筛选出对人宫颈癌HeLa细胞生长有抑制作用的有效部位,采用柱色谱法对有效部位中的活性成分进行分离纯化,利用薄层色谱板检识,将分离纯化得到的活性成分通过液-质联用仪(LC-MS)及核磁共振仪(NMR)进行结构鉴定。采用MTT法对活性成分进行人宫颈癌HeLa细胞增殖抑制试验,并通过Hoechst 33342染色法及流式细胞术方法研究其对HeLa细胞凋亡的影响。通过小鼠的最大耐受量试验对活性成分的安全性能进行评价。同时研究了反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测活性成分的条件。结果表明：石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、氯仿萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位对人宫颈癌HeLa细胞抑制的IC50值分别为158.81 mg/L,40.43 mg/L,130.49 mg/L,137.67 mg/L,5.10E+07 mg/L。说明核桃外果皮的石汕醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物、正丁醇提取物对人宫颈癌HeLa细胞均有一定抑制作用,且随着浓度的提高抑制作用增强,其中氯仿提取物的抑制作用最强。采用硅胶柱色谱,洗脱液为氯仿∶乙酸乙酯(3∶7,V/V),从氯仿提取物中分出的成分,经LC-MS及NMR结构分析,确认为齐墩果酸。采用MTT法检测齐墩果酸对人宫颈癌HeLa细胞的抑制率,齐墩果酸浓度为10-4mol/L时,抑制率达40.22±3.24%；人宫颈癌HeLa细胞经40 mg/L齐墩果酸处理24小时经Hoechst33342染色,在荧光显微镜下可以观察到细胞出现凋亡小体；人宫颈癌HeLa细胞经40 mg/L齐墩果酸处理24小时后经Annexin V-FITC/PI染色后,在流式细胞仪上检测细胞的早期凋亡率为3.93%。对齐墩果酸进行小鼠的最大耐受量试验(MTD),给药方式采用灌胃。结果表明小鼠在给药7天后心、肝、脾、肺等主要的脏器系数均未发现异常,其对齐墩果酸的最大耐受量大于22.2 mg/kg,相当于体重为60 kg的成人每日用量200 mg的200倍。通过研究建立了核桃外果皮中齐墩果酸含量测定的RP-HPLC法,采用色谱柱为Intersil ODS(150 mm×4.6 mm,5μm)流动相为甲醇∶水∶冰乙酸(265∶35∶0.1,V/V)；流速0.8mL/min进样量20μL；检测波长为210 nm；柱温30℃。结果表明齐墩果酸进样量在0.728～7.28μg(r=0.9997)范围内呈现良好的线性关系,齐墩果酸平均回收率(n-9)为101.1%,相对标准偏差(RSD)为2.44%。测得核桃外果皮中齐墩果酸含量为2.1 mg/100g。该方法简便快速,结果可靠准确,重现性和稳定性好。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第1章绪论  8-23
  1.1 核桃属植物概况  8
  1.2 核桃外果皮的研究进展  8-11
  1.3 国内外抗肿瘤植物药的研究进展  11-15
  1.4 宫颈癌的研究进展  15-17
  1.5 核桃属植物中主要活性化学成分的研究概况  17-19
  1.6 植物原料药中有效成分的提取及分离鉴定  19-20
  1.7 齐墩果酸的研究现状  20-21
  1.8 本研究的意义及目的  21-23
第2章核桃外果皮抑制人宫颈癌HeLa细胞有效部位的筛选  23-27
  2.1 试剂与仪器  23
  2.2 试验方法  23-24
  2.3 结果与分析  24-26
  2.4 本章小结与讨论  26-27
第3章核桃外果皮氯仿萃取部位中活性成分分离纯化及结构鉴定  27-33
  3.1 试剂与仪器  27
  3.2 试验方法  27-28
  3.3 结果与分析  28-32
  3.4 本章小结与讨论  32-33
第4章齐墩果酸诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究  33-41
  4.1 试剂及仪器  33
  4.2 试验方法  33-37
  4.3 结果与分析  37-39
  4.4 本章小结与讨论  39-41
第5章齐墩果酸的小鼠最大耐受量试验  41-49
  5.1 材料与设备  41
  5.2 试验方法  41-42
  5.3 试验结果与分析  42-48
  5.4 本章小结  48-49
第6章核桃外果皮中齐墩果酸含量测定方法的建立  49-56
  6.1 试剂与仪器  49
  6.2 试验方法  49-51
  6.3 结果与分析  51-55
  6.4 本章小结与讨论  55-56
第7章结论与展望  56-58
参考文献  58-64
致谢  64-65
作者简介  65

核桃外果皮抑制人宫颈癌HeLa细胞活性成分筛选

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