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稻瘟病菌Mgvam7基因的克隆与功能分析

作　者: 豆献英
导　师: 张正光
学　校: 南京农业大学
专　业: 遗传学
关键词: SNARE BFA 液泡细胞壁结构顶体胞吞作用活性氧
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

稻瘟病是世界上最严重的粮食作物病害之一,由于稻瘟病菌研究的重要经济和社会意义及稻瘟病菌容易培养、遗传转化体系成熟等特点,稻瘟病菌已经成为植物病原真菌研究的模式系统。膜泡运输对于蛋白质的运输和分泌至关重要,其中SNARE蛋白是膜泡运输过程中十分保守的一类蛋白。稻瘟病菌在侵染植物过程中分泌大量的外泌蛋白,而迄今关于膜泡运输系统在植物病原真菌的致病性及其生长发育、细胞分化等方面的作用鲜有报道。为了分析膜泡运输相关组分在稻瘟病菌中的功能,本研究对稻瘟病菌膜泡运输SNARE蛋白基因Mgvam7的功能进行了研究。首先根据同源序列比对,在稻瘟病菌基因组数据库搜索到一个与酵母vam7基因同源的基因,命名为Mgvam7,序列分析表明该基因编码的蛋白含有375个氨基酸,其氨基酸序列与酵母的SNARE蛋白vamp7的同源性仅为24%,该蛋白包含一个PX结构域和一个SNARE结构域;该基因可以互补酵母vam7基因突变体在含有CalcoflourWhite(CFW)的培养基平板上的生长缺陷,同时FM4-64染色显示该基因能够互补酵母突变体液泡形态上的缺陷,表明该基因编码一个具有SNARE蛋白功能的VAM7蛋白。进一步将报告基因eGFP构建在Mgvam7基因的启动子下游来分析该基因表达的组织特异性,结果发现该基因在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞阶段均有表达。采用原生质体转化和同源重组技术获得了稻瘟病菌的Mgvam7敲除突变体,对其多种生物学表型进行了分析,结果显示突变体对金属离子、营养、渗透压等液泡功能相关的胁迫耐受性减弱。已证明在稻瘟病菌中,脂肪粒主要主要存在于液泡中,可以通过采用Nile red染色法观察脂肪粒来分析液泡形态的变化。该染色法发现,与野生型菌株相比,突变体脂肪粒增多,且多呈碎球状,表明突变体的液泡发生片段化。细胞壁和细胞膜胁迫因子处理发现突变体而对SDS更加敏感而对CFW的耐受增加,同时对菌丝进行CFW染色显示突变体细胞壁几丁质分布发生变化。顶体结构是真菌菌丝顶端重要的细胞器,通常与真菌极性生长、细胞壁合成相关。FM4-64染色观察到突变体菌丝顶端不能形成正常的顶体结构。同时采用FM4-64跟踪试验观察到突变体不能进行正常的胞吞作用,而BFA处理可以部分恢复突变体的胞吞作用,表明BFA作用于Mgvam7的下游调控胞吞作用。已证明活性氧对真菌发育和极性生长有重要调节作用,利用荧光染料对菌丝顶端活性氧染色发现突变体内活性氧积累显著减少。进一步产孢分析发现突变体存在严重的产孢缺陷,采用菌丝片段离体接种发现突变体均不能侵染大麦和水稻。综上研究表明Mgvam7既可以维持液泡形态和功能,同时对细胞壁完整性、胞吞作用、活性氧积累、分生孢子的产生及其致病性均有调控作用,提示MgVAM7在稻瘟病菌的生长、发育、致病性过程中是一个功能多样化的SNARE蛋白。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
上篇文献综述  10-30
  第一章稻瘟病菌研究进展  11-21
    1 稻瘟菌的基因组学研究  11-12
    2 稻瘟病菌侵染植物的早期事件  12
    3 稻瘟病菌的附着胞生理学  12-13
    4 与稻瘟病菌侵染发育相关的MAPK信号通路  13-14
    5 稻瘟病菌的植物组织侵染  14-15
    6 稻瘟病菌的功能基因组学  15-16
    7 基因沉默在稻瘟病菌功能基因组学研究中的应用  16-17
    参考文献  17-21
  第二章膜泡运输、SNARE蛋白及其调节  21-30
    1 膜泡运输  21-22
    2 SNARE蛋白家族及其调节  22-26
      2.1 SNARES蛋白  22-25
      2.2 对SNARE蛋白的调节  25-26
    参考文献  26-30
下篇研究内容  30-88
  第一章 MGVAM7基因的克隆、酵母互补和表达分析  31-50
    1 材料与方法  32-38
      1.1 供试菌株及培养条件  32-33
      1.2 膜泡运输抑制剂BFA对稻瘟病菌生长、孢子萌发、附着胞形成的影响  33-34
      1.3 稻瘟病菌DNA、RNA的提取和cDNA的合成  34-35
      1.4 Mgvam7基因的克隆及序列分析  35-37
      1.5 酵母互补试验  37
      1.6 利用eGFP报告基因对稻瘟病菌基因Mgvam7的表达分析  37-38
    2 结果与分析  38-46
      2.1 膜泡运输的抑制剂影响稻瘟病菌的菌丝生长,孢子萌发和附着胞形成率  38-39
      2.2 Mgvam7基因编码一个SNARE蛋白  39-44
      2.3 Mgvam7基因能够互补酵母vam7敲除突变体的表型  44-45
      2.4 Mgvam7基因在稻瘟病菌菌丝、孢子、附着胞中均有表达  45-46
    3 讨论  46-47
    参考文献  47-50
  第二章稻瘟病菌MGVAM7基因突变体的构建和表型分析  50-88
    1 材料与方法  52-60
      1.1 菌株与培养条件  52
      1.2 试验常用的培养基  52-55
      1.3 稻瘟病菌DNA和RNA的提取和操作  55
      1.4 基因敲除载体的构建和突变体的获得  55-56
      1.5 突变体菌丝生长表型分析  56
      1.6 突变体的细胞壁完整性分析  56-58
      1.8 菌丝顶端的活性氧变化  58
      1.9 突变体的产孢分析突变体在产孢培养基上的菌丝生长及产孢分析  58-59
      1.10 突变体的致病性分析  59
      1.11 突变体的基因互补实验  59-60
    2 结果与分析  60-81
      2.1 敲除载体的构建和获得  60-62
      2.2 突变体菌丝生长的表型分析  62-65
      2.3 Mgvam7基因敲除突变体在液泡功能和结构上存在缺陷  65-67
      2.4 Mgvam7基因敲除突变体的细胞壁完整性发生改变  67-71
      2.5 Mgvam7基因敲除突变体顶体结构观察和胞吞作用分析  71-75
      2.6 突变体菌丝内活性氧的分布减少  75-77
      2.7 Mgvam7基因敲除突变体存在严重的产孢缺陷  77-79
      2.8 突变体丧失致病性  79-80
      2.9 野生型基因可以互补突变体多方面的缺陷  80-81
    3 讨论  81-84
    参考文献  84-88
附录  88-89
攻读硕士学位期间发表的研究论文  89-90
致谢  90

稻瘟病菌Mgvam7基因的克隆与功能分析

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