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生长素信号对植物生长与系统性获得抗性的调控作用

作　者: 王晓莉
导　师: 董汉松
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 组成性的系统获得抗性(cSAR) ces1-1 IAA 植物生长抗病防卫核黄素受体基因(riboflavin receptor gene，RfBP) 绿色荧光蛋白转基因拟南芥
分类号: S432.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

生长素是一类参与植物发育过程的典型植物激素,这种非蛋白的简单分子参与调控:胚的形态建成、细胞分裂与伸长、维管组织的分化、侧根的起始生成、向地性和向光性等。同时,在分子水平上,生长素还调控着无数基因的表达。近年来的研究,尤其是生长素受体转运抑制响应蛋白(transport inhibitor response protein 1,TIR1)和疑似受体生长素结合蛋白(auxin binding protein 1,ABP1)的发现,使得生长素信号通路得到简洁清晰的解析。最近的研究发现,水杨酸全面抑制生长素相关基因的表达,且水杨酸对生长素信号通路的抑制是水杨酸介导的抗病防卫反应机制的一部分,说明生长素在植物防卫过程中也起着重要作用。然而,这样一个看似简单的信号通路是如何参与调控植物中无数的发育过程的,生长素又是如何共同调控植物生长与防卫的,这些问题还有待进一步解析。另外,植物非激素信号对生长与防卫具有重要调控作用,其中,核黄素不仅可以诱导植物抗病性,还能促进植物生长。在表达软体海龟核黄素受体基因的转基因植物中,核黄素含量下降,植物生长加快、抗病性提高,但其调节机制还不了解。本文着重研究生长素信号对植物生长和抗病性的调控作用;为了进一步探讨激素信号与核黄素对植物生长发育和抗病性的不同调控作用,本文还构建了核黄素受体与荧光蛋白的融合蛋白,产生了转基因拟南芥,用于进一步研究。1.一种生长素抑制蛋白调控烟草矮化突变体的组成性系统获得抗性植物中的系统获得抗性(systematic acquired resistance,SAR)是由多种激发子诱导产生的。在对激发子的反应过程中,锚蛋白NPR1(non-expressor of PR)的主要功能是调控植物防卫基因的表达,这些基因包括SAR相关基因以及像hsr203和hinl这样的过敏反应相关基因。这些基因编码防卫产物包括病程相关(pathogenesis-related,PR)蛋白、几丁质酶或者其它可以抵抗病原物的酶。这些产物共同作用来防止病原物的侵染和致病,从而使植物产生抗病表型。因而,防卫反应基因的表达和系统抗性的产生被认为是SAR的主要特征。在特殊环境之下,一旦植物的遗传特性被修饰,SAR的特征就会通过繁殖变成组成性的和可遗传的。在这种情况下,组成性表达SAR(cSAR)可以遗传到植物的有性后代中,抗性反应基因的表达可以不依赖激发子的存在。人们已经应用了许多方法来修饰植物的遗传特性和改变SAR的特性。一种植物工程方法是将防卫调控基因融合到一个组成性表达的启动子上,诸如花椰菜花叶病毒来源的35S启动子。遗传突变广泛的应用于标记包括正向及负向调控抗病反应的植物基因。一种常规的诱变方法是在植物的胚体的无性繁殖过程中,如细胞或组织培养和植物再生过程,对其进行无性系变异。这个过程能够使由SAR激发子引发的植物遗传变异稳定下来,从而改变SAR特性的遗传方式。为了研究植物生长和系统获得抗性的共同调控作用,我们对野生型烟草(Nicotiana tabacum)进行体细胞无性系变异处理,得到组成性表达SAR的突变体cesl-l。与野生型相比,cesl-l表型矮化但却对真菌的侵染表现抗性。这种突变体能组成性的表达植物抗病反应基因,但是却不能表达植物生长途径中的伸展素expansin基因。回交的遗传分析表明,cesl-l是在野生型位点上的单基因显性突变。差异显示表明,在cesl-l中存在一个与编码生长素抑制蛋白的基因NtARPl一致的转录本,而野生型烟草中缺少此转录本。我们通过cDNA末端快速扩增(rapid amplification ofcDNA ends,RACE)的方法克隆到NtARPl基因,并检测了生长素对基因表达的影响及植物中NtARPl的蛋白产物。将NtARPl基因进行瞬时表达,发现NtARPl定位在cesl-l的细胞核上。经过吲哚乙酸IAA处理的cesl-l,其NtARPl的表达和NtARPl蛋白产物的产生均受到抑制。我们进而对NtARPl在调控烟草的生长防卫功能上进行了研究。当突变体cesl-l中的NtARPl被沉默时,其生长恢复了野生型的表型,但是丧失了组成性表达SAR的特性。cesl-l中的IAA含量低于野生型,然而,外部施用IAA可以使cesl-l中IAA含量恢复到野生型水平。实验结果表明,存在一条生长素信号通路负向调控植物的生长而正向调控防卫。2.核黄素受体基因转基因拟南芥的产生和鉴定核黄素在生物体内形成黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)及黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenjne dinucleotide,FAD),它们是黄素酶的辅酶。核黄素所形成的辅酶参与机体组织维生素C抗氧化作用的呼吸电子传递及氧化还原过程,参与植物抗氧化及过氧化过程,从而影响氧化性损伤及后续过敏反应过程中活性氧中间体(reactive oxygen species,ROS)的产生,而ROS是过敏细胞坏死的重要信号,能调节生长、抗病、抗虫、抗逆,所以核黄素与植物免疫反应有关。外施核黄素可以诱导植物抗病性。植物中的核黄素水平可能对抗病防卫和生长发育过程有影响。因此,如果能够控制核黄素水平就能相应控制这些重要过程,提高植物抗病防卫的能力并促进植物生长发育。以此为切入点,可以研究核黄素参与的植物防卫和生长调控的交叉点。本实验室已经克隆到了中华鳖的核黄素受体(riboflavin binding protein,RfBP)基因。本研究将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因融合构建的核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein,RfBP)基因转入拟南芥中,来研究RfBP蛋白在植物细胞内的定位,进而研究RfBP蛋白在植物发育和防卫信号传导中的作用。将来自软体海龟的RfBP基因连入植物表达载体pBI121中,用水母绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)标记,构建了植物重组表达质粒pBI121-RfBP-GFP,由农杆菌Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105介导,转化拟南芥生态型Columbia(Col-0)。获得了抗卡那霉素的转基因纯合拟南芥植株,经PCR,RT-PCR,Southern blot,Western blot和荧光显微观察检测,证明RfBP基因已整合到拟南芥基因组中。本研究为进一步解析植物核黄素信号识别与传导奠定了基础。

全文目录

中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-12
文献综述  12-23
  第一章生长素信号通路解析  12-17
    一、生长素的受体  13-14
    二、ARFs和Aux/IAA的作用机制研究  14-16
    三、生长素与植物防卫反应  16-17
  第二章核黄素在植物生长发育与防卫中的重要作用  17-23
    一、核黄素的合成  17-20
    二、核黄素在植物抗病防卫和生长信号传导中的作用  20-23
研究报告  23-55
  第一章一种生长素抑制蛋白调控烟草矮化突变体的组成性系统获得抗性  23-43
    1 材料和方法  25-29
    2 结果  29-40
      2.1 ces1-1的鉴定  29-31
      2.2 差异显示证实ces1-1中的重要基因的转录  31-33
      2.3 NtARP1的鉴定  33-35
      2.4 NtARP1的生物信息学特征  35-37
      2.5 NtARP1在植物生长和防卫中的功能  37-39
      2.6 生长素对植物生长和防卫的影响  39-40
    3 讨论  40-43
  第二章核黄素受体基因转基因拟南芥的产生和鉴定  43-55
    1.材料和方法  44-48
    2.结果与分析  48-53
      2.1 植物表达载体pBI121-RfBP-GFP的构建  48-49
      2.2 农杆菌介导的pBI121-RfBP-GFP的拟南芥转化及转基因植株的产生  49-51
      2.4 转RfBP-GFP基因拟南芥的Southern杂交检测  51
      2.5 转RfBP-GFP基因拟南芥的RT-PCR检测  51-52
      2.6 转RfBP-GFP基因拟南芥的Western blot检测  52-53
      2.7 转RfBP-GFP基因拟南芥的荧光检测  53
    3.讨论  53-55
附录  55-63
参考文献  63-68
缩略语  68-70
已发表论文清单  70-72
致谢  72

生长素信号对植物生长与系统性获得抗性的调控作用

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