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水稻抗病相关RNA解旋酶基因OsBIRH1的功能分析及YTH蛋白基因家族的初步研究

作　者: 李大勇
导　师: 宋凤鸣
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻(Oryza sativa L.) 拟南芥，诱导抗性／抗病反应苯并噻二唑稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) DEAD-box RNA解旋酶 OsBIRH1 转基因拟南芥植株 YTH结构域表型异常耐旱性抗氧化胁迫
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

最近的研究表明,DEAD-box RNA解旋酶和RNA结合蛋白在植物的生长发育、激素应答以及对环境逆境反应中起重要作用。在本实验室前期对水稻诱导抗病性的研究中,通过抑制性差减杂交法得到了两个差别表达克隆,预测分别编码DEAD-box RNA解旋酶蛋白和含YTH结构域的未知蛋白。在本研究中,我们通过生化和遗传学手段研究了水稻DEAD-box RNA解旋酶基因OsBIRHI的功能;同时,我们运用生物信息学方法鉴定了水稻和拟南芥中含YTH结构域的基因家族,并对拟南芥YTH家族成员的生化活性和表达模式进行了初步的研究。OsBIRHl基因全长cDNA为2108 bp,其中包含1926 bp的ORF,编码一个含642个氨基酸的蛋白,含有DEAD-box RNA解旋酶蛋白所有的特征性保守结构域。基因结构分析表明OsBIRHI基因位于水稻第3染色体上,由8个外显子和7个内含子组成,在水稻基因组中以单拷贝的形式存在。纯化并获得重组OsBIRHl融合蛋白,分析了重组OsBIRHl蛋白的ATPase活性和RNA解旋活性,结果表明OsBIRHl蛋白具有DEAD-box RNA解旋酶的一般特征,即依赖于RNA的ATPase活性和双链RNA解旋酶活性。Northern分析结果表明,OsBIRHl基因在水稻植株体内有一定水平的基础表达,但BTH、SA、ACC和JA等抗病信号分子能诱导OsBIRHl基因的表达,且在水稻幼苗与稻瘟菌（Magnaporthegrisea）非亲和性互作中在接种后6 h时就快速激活表达,而在亲和性互作的感病水稻幼苗中几乎检测不到OsBIRHl的诱导表达。利用转基因拟南芥植株进行了OsBIRHl的功能分析。将OsBIRHl的编码框序列克隆进含有CaMV35S启动子的载体pCAMBIA99-1,构建了水稻OsBIRHl基因的植物转化双元表达载体。通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的蘸花法将OsBIRHl基因转化拟南芥,Hyg⁺抗性和PCR筛选获得15株转OsBIRHl基因T1代拟南芥植株。Southern分析表明1～2个拷贝的OsBIRHl基因己整合到拟南芥基因组DNA中。RT-PCR分析结果表明所检测的OsBIRHl转基因烟草T3代单拷贝纯合体植株都能够正常表达。抗病性测定表明,这些转基因植株提高了对Alternaria brassicicola、Pseudomonas swingae pv tomam DC3000的抗病性,这些转基因植株中PR-1、PR-2、PR-5、PDF1.2基因都有组成型增强表达。此外,转OsBIRHI基因植株对干旱胁迫和氧化胁迫都表现出一定的抗性。这些结果表明OsBIRHI编码了一个DEAD-box RNA解旋酶,而且在植物抗病和抗逆方面扮演着重要的角色。最近,运用生物信息学方法在蛋白数据库中鉴定发现一类非常保守的未知功能蛋白,并且推测这些包含保守结构域YTH的蛋白可能具有RNA结合的活性。为了深入了解这些含YTH结构域蛋白的生物学功能,我们运用生物信息学方法在拟南芥和水稻基因组中分别鉴定了13和12个基因,命名为AtYTH01-13和OsYTHOI-12。这些结果表明在高等植物中含有YTH结构域的蛋白组成一个相对较小的基因家族。拟南芥和水稻的YTH家族成员蛋白都包含一个非常保守的YTH结构域,但是在这个结构域外还没有发现其它已知的或者保守的结构域。将AtYTH05和AtYTH07的编码区ORF克隆进原核表达载体,纯化获得重组的蛋白。凝胶阻滞试验的结果发现重组的AtYTH05融合蛋白能够在体外与单链RNA相结合,表明YTH蛋白具有RNA结合活性。同时,我们也用RT-PCR的方法分析了拟南芥YTH家族所有成员的表达模式,结果显示拟南芥YTH家族基因的表达都存在着组织和时空的特异性。我们还克隆了AtYTH05和AtYTH07的启动子,构建Promoter::GUS融合基因并转化拟南芥,GUS染色结果显示这两个基因的表达受开花的强烈诱导,这与RT-PCR的结果相一致。我们的初步研究结果表明,YTH家族是一个新的RNA结合蛋白类群,并且可能在植物的生长和发育上起重要作用。

全文目录

致谢  9-11
摘要  11-13
Abstract  13-16
第一章文献综述和研究背景  16-35
  1.1 植物的先天免疫系统(innate immunity)  16-17
  1.2 植物的诱导免疫系统(induced immunity)  17-22
    1.2.1 SAR及其SA信号途径  18-20
    1.2.2 ISR及其JA/ET信号途径  20-22
  1.3 DEAD box RNA解旋酶  22-28
    1.3.1 DEAD-box RNA解旋酶的序列特征与生化活性  23-24
    1.3.2 DEAD-box蛋白家族成员的细胞功能  24-26
    1.3.3 DEAD-box RNA解旋酶在植物中的作用  26-28
  1.4 RNA结合蛋白  28-34
    1.4.1 蛋白质识别的RNA的二级结构单元  29
    1.4.2 蛋白质中的RNA结合结构域  29-31
    1.4.3 植物RNA结合蛋白的作用  31-34
  1.5 本研究的目的意义和主要研究内容  34-35
第二章水稻抗病相关DEAD-box RNA解旋酶基因OSBIRH1的功能分析  35-77
  2.1 前言  35-37
  2.2 材料与方法  37-50
    2.2.1 供试稻瘟菌菌株与接种  37-38
    2.2.2 水稻幼苗培育与处理  38
    2.2.3 OsBIRH1 cDNA基因的克隆  38-39
    2.2.4 DNA的序列测定和分析  39-40
    2.2.5 OsBIRH1融合蛋白的原核表达  40-42
    2.2.6 OsBIRH1蛋白的体外RNA解旋和RNA结合活性分析  42-43
    2.2.7 ATPase活性测定  43
    2.2.8 植物组织总RNA和基因组DNA的提取  43-44
    2.2.9 Northern和Southern杂交  44-45
    2.2.10 水稻OsBIRH1基因植物转化双元表达载体的构建  45-46
    2.2.11 拟南芥转化以及转基因植株的筛选鉴定  46-47
    2.2.12 转基因拟南芥植株PR基因的RT-PCR表达分析  47-48
    2.2.13 转OsBIRH1基因拟南芥的抗病性测定  48-49
    2.2.14 转OsBIRH1基因拟南芥对干旱和ABA的反应  49
    2.2.15 叶绿素含量的测定  49-50
  2.3 结果与分析  50-56
    2.3.1 OsBIRH1基因全长cDNA序列的克隆及序列分析  50
    2.3.2 OsBIRH1蛋白的结构与系统进化树分析  50-51
    2.3.3 OsBIRH1蛋白依赖RNA的ATPase活性  51
    2.3.4 OsBIRH1蛋白的RNA解旋活性  51-52
    2.3.5 OsBIRH1基因在水稻抗病反应中的差异表达  52-53
    2.3.6 OsBIRH1基因植物转化双元表达载体的构建  53
    2.3.7 转OsBIRH1基因的拟南芥的分子鉴定  53
    2.3.8 转OsBIRH1基因拟南芥植株提高了对不同病原菌的抗病性  53-54
    2.3.9 过量表达OsBIRH1基因的转拟南芥植株中PR基因的表达  54-55
    2.3.10 转OsBIRH1基因拟南芥植株提高对ABA的敏感性和干旱的抗性  55
    2.3.11 转OsBIRH1基因拟南芥植株提高对氧化胁迫的抗性  55-56
  2.4.讨论  56-77
第三章拟南芥和水稻YTH结构域RNA结合蛋白家族的初步研究  77-104
  3.1 前言  77-81
  3.2 材料和方法  81-87
    3.2.1 供试拟南芥生长与培育  81
    3.2.2 拟南芥和水稻YTH结构域蛋白基因的鉴定  81
    3.2.3 AtYTH05/07融合蛋白的纯化  81-82
    3.2.4 AtYTH5蛋白的体外RNA结合活性分析  82
    3.2.5 AtYTH05、AtYTH07基因Promoter::GUS载体的构建  82-83
    3.2.6 拟南芥的转化  83
    3.2.7 植物组GUS染色  83
    3.2.8 拟南芥突变体纯合体的筛选  83-85
    3.2.9 拟南芥YTH基因的表达分析  85-87
  3.3 结果与分析  87-92
    3.3.1 拟南芥和水稻中YTH家族成员的鉴定  87-88
    3.3.2 拟南芥和水稻中YTH家族蛋白的序列分析  88-89
    3.3.3 AtYTH5蛋白的RNA结合活性  89-90
    3.3.4 拟南芥YTH家族成员基因的表达分析  90
    3.3.5 拟南芥AtYTH05和AtYTH07基因的启动子活性  90-91
    3.3.6 拟南芥YTH家族T-DNA敲除纯合体的筛选鉴定  91-92
  3.4 讨论  92-104
第四章全文小结和今后研究  104-107
参考文献  107-128

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