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藏鸡生产性能研究及鸡三个基因的分离、SNPs检测及其与经济性状的关联分析

作　者: 朱志明
导　师: 刘榜；李奎
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 藏鸡生产性能新基因分离 SNPs 经济性状关联分析表达谱
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

藏鸡是我国青藏高原在原始饲养状态下保存下来的珍贵家禽品种。藏鸡具有耐寒、抗病、抗缺氧、肉质鲜美、药用价值较高，耐粗放和可观赏性强等优良特性，同时也有生长速度慢、产蛋率低的缺点。如何在保存好这一珍贵遗传资源的同时，一方面在不影响藏鸡优良特性的情况下通过引入杂交改良藏鸡的缺点以培育新藏鸡，另一方面通过经济杂交和产品开发利用好藏鸡就成为当前重要的研究课题。本研究在农业部“948”项目的基础上，针对目前藏鸡研究现状，一方面通过引进国外优良鸡种对藏鸡进行杂交利用，另一方面利用我室所建藏鸡腿肌全长cDNA文库信息及侯选基因策略，采用生物信息学与分子生物学技术相结合的方法，克隆和分离与重要经济性能有关的新基因，为分子标记辅助选择育种提供分子遗传基础。主要取得了如下结果：1．对藏鸡、隐性白羽鸡和藏隐F1代(藏鸡♂×隐性白羽鸡♀)的产蛋性能进行分析，发现藏隐F1代64周龄产蛋数、蛋重及蛋的大小都较藏鸡显著提高(P＜0.05)。同时，对藏鸡、隐性白羽鸡、藏隐F1代及75％藏鸡血液的杂种(藏♂×藏隐F1♀)早期生长发育进行了比较，结果表明：藏隐F1代的各周龄体重、周增重及胫长生长情况都高于75％藏鸡血液的杂种和纯藏鸡，达到显著水平(P＜0.05)。2．运用三种非线性模型Logstic、Gompertz、von Bertalanffy对藏鸡的早期生长发育规律进行了曲线模拟。三种模型都能较好的模拟藏鸡的生长发育规律，但Gompertz更加适宜模拟藏鸡的生长过程。3．依据本实验室所建藏鸡腿肌全长cDNA文库信息及侯选基因策略，分离并鉴定了鸡MyoT基因的全长cDNA序列，并获得了Cacngl和Camk2d基因片段。结合鸡基因组序列信息，进一步对MyoT、Cacng1和Camk2d基因氨基酸序列、蛋白质结构进行了初步分析和预测。4．采用了PCR—RFLP、mp-PCR和M-ASP三种方法检测了MyoT、Cacng1和Camk2d等3个基因7个位点的多态性和Cacng1基因第2内含子长片段的插入／缺失造成的PCR产物长度多态性，分析了部分多态位点在不同鸡种中的基因型频率和基因频率，并分析了各基因型在不同鸡种中的分布差异。5．在我室与西藏大学农牧学院合作所建立的试验群体(藏鸡、隐性白羽鸡、藏隐F1代和75％藏鸡血液的杂种)中采用：疗差分析的最小二乘法分析了上述三个基因的酶切位点多态性与部分经济性状的关联。结果发现：①MyoT基因第10外显子Hin6I多态位点不同基因型与腿肌重、腿肌率、全净膛率和腿肌肉色显著关联(P＜0.05)；3’-UTR区Rsa I多态位点不同基因型与屠体重、皮下脂肪厚显著关联(P＜0.05)；采用mp-PCR方法在3’-UTR引入了—BsuR I多态位点，发现不同基因型与屠体重、肌间脂肪宽、半净膛重、全净膛重间差异显著(P＜0.05)。②Cacngl基因第2内含子的长片段插入／缺失位点LS与SS基因型个体间嫩度差异极显著(P＜0.01)；第4外显子MspⅠ多态位点不同基因型与嫩度和腿肌肉色显著关联(P＜0.05)：Cacngl基因第5外显子M-ASP多态位点不同基因型与肝重、滴水损失显著关联(P＜0.05)，与胸肌肉色极显著相关(P＜0.01)；3’-UTR区MspⅠ多态位点不同基因型与腿肌肉色显著关联(P＜0.05)，并发现该多态位点与滴水损失也存在相关趋势(P=0.072)。③Camk2d基因第15外显子VspⅠ多态位点不同基因型与腹脂重极显著关联(P＜0.01)，与pH值显著关联(P＜0.05)。6．以成年白来航母鸡的心、肝、脾、肺、肾、脑和肌肉七种组织作为研究材料，采用半定量RT-PCR方法研究鸡MyoT和Cacngl基因在各组织的表达谱和表达规律，结果发现MyoT基因在心脏和肌肉中表达；Cacngl基因在心、肝、肾、大脑和肌肉中都表达。同时进一步分析了MyoT和Cacngl基因在不同组织中的表达差异，MyoT，在心脏的表达量高于肌肉的表达量；Cacngl在肌肉的表达量最高，其次是心脏、肾脏、大脑，在肝脏中的表达量最低。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
1 文献综述  12-24
  1.1 藏鸡遗传资源现状及研究现状  12-14
    1.1.1 藏鸡遗传资源现状  12-13
      1.1.1.1 藏鸡的体型外貌  12
      1.1.1.2 藏鸡的生产性能  12-13
    1.1.2 藏鸡研究现状  13-14
  1.2 鸡基因组研究现状  14-16
  1.3 新基因的克隆方法  16-17
  1.4 SNP的研究进展及应用  17-21
    1.4.1 SNP的特点  17-18
    1.4.2 SNP的检测方法  18-21
      1.4.2.1 基于生物信息学SNPs侯选法  18-19
      1.4.2.2 直接测序法  19
      1.4.2.3 分子杂交法  19
      1.4.2.4 基于PCR法  19-21
  1.5 三个拟分离基因的研究进展  21-24
    1.5.1 MyoT基因  21-22
    1.5.2 Cacngl基因  22-23
    1.5.3 Camk2d基因  23-24
2 本研究的目的和意义  24-25
3 材料与方法  25-39
  3.1 材料  25-30
    3.1.1 样品  25-28
      3.1.1.1 生长性状资料  25
      3.1.1.2 产蛋性状资料  25
      3.1.1.3 DNA样品  25-28
      3.1.1.4 组织样品  28
    3.1.2 主要仪器设备  28
    3.1.3 培养基、酶及试剂盒  28
    3.1.4 主要试剂及配制  28-29
      3.1.4.1 主要试剂  28-29
      3.1.4.2 主要试剂配制  29
    3.1.5 菌株  29
    3.1.6 主要分子生物学软件和数据库及统计软件  29-30
      3.1.6.1 主要分子生物学软件  29-30
      3.1.6.2 常用分子生物学数据库  30
      3.1.6.3 主要数据分析及统计软件  30
  3.2 方法  30-39
    3.2.1 藏鸡生长发育规律主要研究方法  30-31
      3.2.1.1 藏鸡生长发育规律(0-16周龄)研究方法  30
      3.2.1.2 数据分析方法  30-31
    3.2.2 鸡MyoT、Cacngl和Camk2d基因片段的分离方法  31-33
      3.2.2.1 PCR扩增引物设计  31-32
      3.2.2.2 PCR扩增条件  32
      3.2.2.3 PCR产物的纯化、克隆和测序  32-33
      3.2.2.4 DNA序列同源性检索鉴定  33
      3.2.2.5 cDNA序列分析  33
    3.2.3 鸡中几个侯选基因的SNP检测  33-36
      3.2.3.1 MyoT基因  34
      3.2.3.2 Cacngl基因  34-36
      3.2.3.3 Camk2d基因  36
    3.2.5 侯选基因与鸡经济性状的关联分析  36-37
    3.2.6 半定量RT-PCR进行MyoT和Cacngl基因组织表达谱研究的方法  37-39
      3.2.6.1 总RNA的提取、检测、DNase-Ⅰ处理及纯化  37-38
      3.2.6.2 RNA的反转录(Reversetranscription,RT)  38
      3.2.6.3 PCR反应  38-39
4 结果  39-65
  4.1 各群体性能测定结果  39-43
    4.1.1 藏鸡、隐性白羽鸡和藏隐F1代产蛋性能分析  39-40
    4.1.2 藏鸡、隐性白羽鸡、藏隐F1代及75％藏鸡血液的杂种生长性能分析  40-43
      4.1.2.1 藏鸡早期生长曲线(0-16周龄)的拟合与分析  40-42
      4.1.2.2 藏鸡、隐性白羽鸡、藏隐F1代及75％藏鸡血液的杂种早期生长发育的比较  42-43
  4.2 鸡MyoT、Cacngl和Camk2d基因片段的分离、序列分析及鉴定结果  43-46
    4.2.1 引物特异扩增结果  43-45
    4.2.2 分离片段的序列分析与鉴定  45-46
      4.2.2.1 鸡MyoT基因氨基酸序列分析结果  45
      4.2.2.2 鸡Cacngl基因氨基酸序列分析结果  45-46
      4.2.2.3 鸡Camk2d基因氨基酸序列分析结果  46
  4.3 鸡MyoT基因、Cacngl基因和Camk2d基因遗传变异的检测  46-58
    4.3.1 鸡MyoT基因遗传变异的检测  46-52
      4.3.1.1 鸡MyoT基因第10外显子和3’-UTR突变位点的发现  46-47
      4.3.1.2 鸡MyoT基因第10外显子Hin6Ⅰ酶切位点多态性的检测结果  47-48
      4.3.1.3 鸡MyoT基因3′-UTR区RsaⅠ酶切位点多态性的检测结果  48-50
      4.3.1.4 鸡MyoT基因3’-UTR区BsuRⅠ酶切位点多态性的检测结果  50-52
    4.3.2 鸡Cacngl基因遗传变异的检测  52-56
      4.3.2.1 鸡Cacngl基因第2内含子,第3、4、5外显子及3′-UTR区突变位点的发现  52
      4.3.2.2 鸡Cacngl基因第2内含子长片段缺失／插入的检测结果  52-53
      4.3.2.3 鸡Cacngl基因第4外显子MspⅠ酶切位点多态性的检测结果  53
      4.3.2.4 鸡Cacngl基因第5外显子多态位点的检测结果  53-54
      4.3.2.5 鸡Cacngl基因3’-UIRMspI酶切位点多态性的检测结果  54-56
    4.3.3 鸡Camk2d基因遗传变异的检测  56-58
      4.3.3.1 鸡Camk2d基因第15外显子突变位点的发现  56
      4.3.3.2 鸡Camk2d基因第15外显子VspⅠ酶切位点多态性的检测结果  56-58
  4.4 部分多态位点与鸡部分经济性状间的关联分析  58-63
    4.4.1 鸡MyoT基因  58-60
      4.4.1.1 Hin6Ⅰ酶切多态位点与部分经济性状间的关联分析  58-59
      4.4.1.2 RsaⅠ酶切位点多态与部分经济性状间的关联分析  59
      4.4.1.3 BsuRⅠ多态位点多态与部分经济性状间的关联分析  59-60
    4.4.2 鸡Cacng1基因  60-62
      4.4.2.1 第2内含子长片段插入／缺失与部分经济性状间的关联分析  60
      4.4.2.2 第4外显子MspⅠ酶切位点与部分经济性状间的关联分析  60-61
      4.4.2.3 第5外显子M-ASP位点与部分经济性状间的关联分析  61-62
      4.4.2.4 3′-UTR区MspⅠ酶切位点与部分经济性状间的关联分析  62
    4.4.3 鸡Camk2d基因第15外显子VspⅠ多态位点与部分经济性状间的关联分析  62-63
  4.5 利用半定量RT-PCR研究鸡MyoT及Cacngl基因组织表达结果  63-65
    4.5.1 总RNA的提取和检测结果  63
    4.5.2 鸡MyoT和Cacmgl基因表达谱分析  63-65
5 讨论  65-70
  5.1 关于藏鸡生长发育规律的研究  65-66
    5.1.1 关于生长模型的选择  65
    5.1.2 关于藏鸡生长曲线的拟合  65-66
  5.2 关于SNPs的检测  66-67
  5.3 关于Cacngl基因第2内含子长片段的插入／缺失  67-68
  5.4 关于基因与部分经济性状的关联分析  68-69
  5.5 关于表达谱研究的分析  69-70
6 小结  70-72
  6.1 本研究的主要成果  70-71
  6.2 本研究的创新点与特色  71
  6.3 本研究的不足之处及引出的问题  71-72
参考文献  72-79
附录1 鸡MyoT基因cDNA序列和推导出的氨基酸序列  79-81
附录2 鸡、人、小鼠和大鼠的MyoT氨基酸序列比对图  81-82
附录3 鸡、人、小鼠和大鼠的Cacngl氨基酸序列比对图  82-83
附录4 鸡、人、小鼠和大鼠的Camk2d氨基酸序列比对图  83-84
附录5 缩略词表  84-85
在读其间撰写论文题录  85-86
致谢  86

藏鸡生产性能研究及鸡三个基因的分离、SNPs检测及其与经济性状的关联分析

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