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猪骨骼肌卫星细胞的分离培养及TRIM55基因的染色体定位、SNP检测和表达谱分析

作　者: 张定校
导　师: 李奎；樊斌
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 骨骼肌 卫星细胞 原代培养 TRIM55基因 基因定位 时空表达谱 性状关联
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


骨骼肌卫星细胞(Skeletal muScle satellite cells)是骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之问的具有增殖分化潜力的肌源性干细胞。一般状态下骨骼肌卫星细胞是静息的，当其被激活后，便具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌细胞的能力。由于骨骼肌卫星细胞在骨骼肌早期生长发育以及再生中扮演着非常重要的地位，因此骨骼肌卫星细胞已成为当前的研究热点之一。提高商品猪的胴体瘦肉产量及胴体品质是养猪生产中的重要目标之一。而瘦肉率及胴体品质的提高有赖于骨骼肌的生长状况。为了研究肌细胞的生长发育规律、了解肌细胞形态结构的变化以及开展与骨骼肌生长发育相关新基因的功能研究，都需通过猪骨骼肌卫星细胞来进行研究。因为在体内环境条件下，很难对其开展深入研究。体外原代培养则提供了一种新手段本试验采用胶原酶消化法，从初生仔猪背最长肌中分离骨骼肌卫星细胞，而后利用差速贴壁法对其进行纯化，初步建立了猪骨骼肌卫星细胞的体外原代培养方法。本研究结果表明，该方法简便、快捷且有效，所分离的骨骼肌卫星细胞具有分裂、分化的潜能，可用于进一步对猪骨骼肌细胞分化、增殖与生长的体外研究。猪骨骼肌卫星细胞的体外原代培养技术的建立，为本实验室提供一个猪骨骼肌卫星细胞试验操作平台；同时为开展与猪骨骼肌生长发育相关基因的功能研究奠定了基础。环指蛋白(RING finger protein，RNF)参与许多基本的细胞生理过程，如信号转导、泛素蛋白酶降解途径、基因转录、细胞分化和组织形态发生等。TRIM55(tripartite motif-containing 55)基因(又名MURF-2，RNF29)是最近在人和小鼠中鉴定出的RNF超家族成员之一。已有研究表明TRIM55基因在肌细胞的生长发育中有着重要作用，它通过与肌原纤维和微管的结合来行驶细胞骨架之间调节和信号传导分子的作用．本研究将TRIM55基因作为影响猪骨骼肌生长发育的候选基因开展研究，通过对其进行分离、染色体定位、时空表达谱分析、SNPs检测及与性状的关联分析，为进一步研究该基因在猪骨骼肌生长发育中的功能打下基础，并为其将来应用于分子标记辅助选择(MAS)育种提供分子遗传基础。主要研究结果如下：1．依据人TRIM55基因cDNA信息，在NCBI数据库中搜索猪EST信息，将搜索到的猪EST拼接成EST重叠群。以该序列信息为基础设计引物，分离到猪TRIM55基因3’非翻译区(UTR)的2条序列，GenBank收录号分别为DQ160212和DQ160211。2．利用猪×啮齿类辐射杂交板对猪TRIM55基因进行染色体精细定位，结果表明该基因与微卫星8W1475紧密连锁(LOD=9.74)，另外3个与之紧密连锁的微卫星是SW839、SW742和SW1073．其中SW839定位于SSC4q11-14，因此推测TRIM55基因也定位于SSC4q11-14。3．以出生后1天通城猪的肝脏、肾脏、心脏、骨骼肌、脾脏和不同发育时期的骨骼肌组织为材料，利用半定量RT-PCR方法研究了猪TRIM55基因的时空表达谱。结果发现该基因主要在心肌和骨骼肌中表达，在脾中有微弱表达。在通城猪骨骼肌胚胎发育(30-90天胚胎)过程中呈上调表达，在出生后的骨骼肌发育(1天-成熟期)过程中呈下调表达。4．利用PCR产物直接测序法发现了猪TRIM55基因3’非翻译区(UTR)的2个SNP位点，即A162G和C213T。其中C213T能被限制性内切酶Bsh1236Ⅰ所识别。应用PCR-RFLP技术检测了C／T突变，并分析了不同群体中该突变位点的多态性，计算了该位点的基因型和基因频率，比较了各基因型在不同猪群中的分布差异。5．在本室与通城县畜牧局共同组建的试验群体中的大白、大长通、长白和长大通猪中检测了TRIM55基因3’非翻译区C213T突变位点的多态性，并利用SAS中的广义线型模型(GLM)程序分析了该基因与部分生产性状的关联，初步分析结果表明该基因的Bsh1236Ⅰ-RFLP多态位点与出生至上市平均日增重、肩部膘厚和平均膘厚呈显著关联(P值分别为0.0363，0.0401和0.0473)。

全文目录


第一章 猪骨骼肌卫星细胞的分离培养  7-33
  摘要  8-9
  ABSTRACT  9-10
  1 文献综述  10-18
    1.1 骨骼肌的发生、发育过程及其分子调控机制  10-14
      1.1.1 骨骼肌的发生、发育基本过程  10-11
      1.1.2 骨骼肌发生、发育的分子调控机制  11-14
    1.2 骨骼肌卫星细胞研究进展  14-18
      1.2.1 骨骼肌卫星细胞简介  14-15
      1.2.2 骨骼肌卫星细胞培养的意义  15-16
      1.2.3 骨骼肌卫星细胞培养技术研究现状  16-18
  2 研究目的和意义  18-19
  3 材料与方法  19-23
    3.1 试验材料  19
      3.1.1 试验动物  19
      3.1.2 细胞培养用液及试剂  19
    3.2 主要仪器、设备及器皿  19
    3.3 试验方法  19-23
      3.3.1 试验用品的清洗与消毒  19-20
      3.3.2 细胞培养用液的配制  20-21
      3.3.3 细胞培养瓶的包被  21
      3.3.4 猪骨骼肌卫星细胞的分离  21-22
      3.3.5 猪骨骼肌卫星细胞的原代培养  22-23
  4 结果  23-25
    4.1 骨骼肌卫星细胞的分离  23
    4.2 骨骼肌卫星细胞的纯化  23-24
    4.3 骨骼肌卫星细胞的原代培养  24-25
  5 讨论  25-28
    5.1 关于猪骨骼肌卫星细胞的分离与纯化  25-26
    5.2 关于猪骨骼肌卫星细胞的原代培养  26-27
    5.3 应用猪骨骼肌卫星细胞进行基因功能研究的可行性分析  27-28
  6 本研究获得的结果及对未来工作的建议  28-29
  参考文献  29-33
第二章 猪TRIM55基因的染色体定位、时空表达谱分析和SNP检测  33-83
  摘要  34-35
  ABSTRACT  35-37
  1 文献综述  37-52
    1.1 猪生产性状相关基因与QTL研究现状  37-42
      1.1.1 生长和胴体性状相关候选基因与QTL研究现状  37-40
      1.1.2 肉质性状相关候选基因与QTL研究现状  40-42
      1.1.3 猪骨骼肌生长发育相关候选基因进一步挖掘的必要性  42
    1.2 TRIM55基因的研究进展  42-44
      1.2.1 MURFs基因家族  42-43
      1.2.2 TRIM55基因功能及作为猪骨骼肌生长发育相关候选基因的可能性  43-44
    1.3 猪新基因分离的研究方法  44-52
      1.3.1 mRNA差异显示技术  44-45
      1.3.2 抑制消减杂交  45-47
      1.3.3 基因表达系列分析  47-49
      1.3.4 基因芯片技术  49
      1.3.5 利用CATS引物分离基因  49-50
      1.3.6 根据EST的基因分离  50-52
  2 研究目的和意义  52-53
  3 材料与方法  53-64
    3.1 试验材料  53-56
      3.1.1 试验样品  53-54
      3.1.2 主要仪器设备  54
      3.1.3 主要试剂及配制  54-56
      3.1.4 主要分子生物学软件和统计软件  56
    3.2 方法  56-64
      3.2.1 猪TRIM55基因的分离方法  56-59
      3.2.2 猪TRIM55基因的染色体精细定位—RH法  59-60
      3.2.3 利用半定量RT-PCR分析TRIM55基因时空表达谱的方法  60-63
      3.2.4 猪TRIM55基因的SNP检测  63-64
  4 结果  64-72
    4.1 猪TRIM55基因片段的分离、序列分析与鉴定结果  64-65
      4.1.1 根据猪EST所设计的两对引物扩增猪基因组的结果  64
      4.1.2 所分离片段的序列分析结果  64-65
      4.1.3 序列的同源性分析及结果鉴定  65
    4.2 猪TRIM55基因的染色体精细定位结果  65-67
    4.3 猪TRIM55基因的时空表达谱结果  67-68
      4.3.1 总RNA的提取和检测结果  67-68
      4.3.2 猪TRIM55基因的时空表达谱分析  68
    4.4 猪TRIM55基因的SNP检测  68-72
      4.4.1 TRIM55基因3’-UTR突变的发现  68-69
      4.4.2 TRIM55基因多态位点的遗传多样性检测  69-70
      4.4.3 Bsh1236I-RFLP基因型与生产性状的关联分析  70-72
  5 讨论  72-76
    5.1 关于根据EST的基因分离及引物设计  72-73
    5.2 关于TRIM55基因的物理定位结果  73
    5.3 关于TRIM55基因的时空表达谱分析  73-74
    5.4 关于等位基因频率在猪群间的分布差异问题  74-75
    5.5 关于TRIM55基因与部分生产性状的初步关联分析  75-76
  6 小结  76-78
    6.1 本研究获得的结果  76
    6.2 本研究的创新点与特色  76
    6.3 本研究不足之处及下一步值得研究的工作  76-78
  参考文献  78-83
附录1 缩略词表  83-84
附录2 主要性状的中英文对照和缩写  84-85
在读期间发表的论文题录  85-86
致谢  86

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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