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弗氏枸橼酸杆菌yeeZ基因插入突变导致细菌分裂抑制的机制研究

作　者: 王景
导　师: 丛延广
学　校: 第三军医大学
专　业: 微生物学
关键词: 弗氏枸橼酸杆菌 yeeZ 细菌分裂抑制长丝体
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

分裂是细菌生长、繁殖的基础。菌体的分裂过程需要精准的调控机制来确保其准确性,从而维持正常的生命活动。对分裂过程的任何干扰,都会对细菌生命活动产生重要影响,甚至导致死亡。目前的研究表明,细菌的分裂是一个非常复杂,需要进行严格精确的时空调控的行为,但仍然有许多未知的机制有待进一步的阐释。本实验室在前期对细菌群集运动的研究中,用自杀性质粒对弗氏枸橼酸杆菌ATCC8090菌株进行广泛转座诱变,在众多的突变株中分离出编号为204的转座突变株。该突变株生物学性状发生明显变化,相对野生株其形态显著变长,表现为长丝体。经过反向PCR方法确定发生突变基因为yeeZ基因。为进一步确认此现象,我们利用自杀性载体EK-Ⅱ对弗氏枸橼酸杆菌野生株的yeeZ基因进行单交叉突变,获得的突变株形态同样出现明显的变长。迄今为止,尚无关于yeeZ基因功能的研究报道,通过NCBI网站检索分析得知,大肠杆菌的yeeZ基因编码产物被预测为与糖代谢有关的差向异构酶,可能参与了多糖链的合成。有文献报道,在大肠杆菌中,yeeZ、yeeN两个基因的产物是以蛋白复合物的形式存在,提示YeeZ是通过与YeeN相互作用来发挥功能的,虽然YeeN的确切功能未知,但有研究显示,其突变会导致细菌生长异常。在弗氏枸橼酸杆菌的基因组上,yeeZ基因与其下游的yeeY基因在一个操纵子中。yeeY基因功能同样没有研究报道,根据序列相似性被推测为LysR家族转录调控因子。LysR家族的转录调控因子是原核生物中最主要的转录调控因子,其所调控的基因功能繁多,涉及氨基酸、酶的合成代谢、毒力因子合成、群体感应系统以及运动等,因此理论上也存在调控分裂的可能性。据此,我们针对204株丝状体形成原因提出三种推测:(1)yeeZ基因功能直接涉及分裂,因此其突变后,导致菌体变长;(2)转座子对yeeZ基因的插入突变,并非是表型形成的原因,而是由于极效应导致其下游基因yeeY的失活,而形成丝状体;(3)YeeZ是通过与其它蛋白形成复合体发挥功能,yeeZ基因插入突变后,导致原基因部分片段的表达,干扰了正常功能的发挥,进而导致表型形成。对204株丝状体形成原因的确定,将有助于认识yeeZ基因的功能,并可能发现新的影响细菌分裂的机制。有鉴于yeeZ基因的插入突变导致细菌生长显著缓慢,类似机制有可能应用于减毒疫苗的构建,而对其机制的阐明,将有助于应用研究的开展。据此,我们针对三种推测进行了以下的实验研究:1.革兰阴性菌基因敲除载体pYG4的构建。为方便进行目的基因的功能分析,我们构建了适用于革兰阴性菌基因敲除的载体pYG4。该载体主要包含以下成分:π蛋白依赖性复制起点ori R6K,使构建的质粒只能在表达π蛋白的菌株中复制,对于其它细菌表现自杀性;接合转移基因mob,使载体可以通过简单的接合方式实现转移;多克隆位点序列:EcoRⅠ-XbaⅠ-ApaⅠ-SfiⅠ-SacⅠ-NotⅠ-SpeⅠ-NdeⅠ-SacⅡ-BglⅡ,可以满足克隆需要;反向选择标志sacB该基因编码的酶可将蔗糖分解为对细菌有毒的产物,从而杀死表达它的细菌;正向选择标志卡那霉素抗性片段。该载体适用于对革兰阴性菌进行目的基因的各种突变操作,在使用上比较方便,也具有较广泛的“失活谱”,目前已经得到很好的应用。2.弗氏枸橼酸杆菌yeeZ基因的敲除及形态观察。利用自杀载体pYG4对yeeZ基因进行框架内敲除,敲除是从转录起始位点下游18bp处开始,到终止子上游36bp处终止,有效避免因为极效应而干扰下游基因的表达,且有效的去除了yeeZ基因功能。观察发现敲除株菌体形态没有明显变化,说明yeeZ基因功能的缺失不是导致204突变株形态变长的原因。由此否定上述第一个推测:即yeeZ基因功能直接涉及细胞分裂,突变后会导致菌体变长。3.弗氏枸橼酸杆菌yeeZ、yeeY双基因的敲除及双基因互补株的构建采用同样方法对yeeZ、yeeY双基因进行敲除,但敲除株形态同样没有出现明显的变化。通过PCR扩增yeeZ+yeeY完整基因片段及其调控区域,并将其连接至载体pBR322,将重组质粒导入204突变株,发现菌体形态没有恢复正常。由此否定了第二个推测,说明yeeY基因功能的缺失不是造成204突变株菌体变长的原因。4.204突变株yeeZ基因突变区域分析及表达4.1首先对204株yeeZ基因突变区域序列进行完整克隆,将其克隆到T载体上,目的是观察该突变体对细菌的影响,在实验中我们没有获得带有目的片段载体的大肠杆菌DH5α菌株,但获得了目的片段整合到基因组的同源位置上的大肠杆菌DH5α菌株,该菌株实际上发生了与弗氏枸橼酸杆菌204株类似的插入突变。对其性状观察发现,其在平板上只能有限生长,形成很小的菌落,涂片显示其形成显著的长丝体。这说明yeeZ基因的插入突变也会对大肠杆菌的分裂产生显著的影响。4.2我们采用RT-PCR对204株基因组上转座片段的前后区域的转录情况进行了分析,发现在转座子插入yeeZ基因后,其插入位点的前半部分和后半部分均能转录。4.3采用PCR扩增方式对204突变株yeeZ基因后半部分突变区域进行克隆并测序验证,将该片段连接至载体pBR322,将重组质粒电转入弗氏枸橼酸杆菌野生株,发现该部分片段对菌体形态没有产生明显影响。4.4采用PCR扩增方式对204突变株yeeZ基因前半部分突变区域进行克隆。首先将该片段连接至T载体,将重组质粒电转入大肠杆菌DH5α发现部分克隆生长异常,表现为迟缓生长或者不生长,对能够正常生长的克隆进行测序发现均有不同的突变。于是我们重新扩增yeeZ基因前部分片段(从yeeZ基因起始密码子后开始扩增),将其连接至载体pBAD24,进行阿拉伯糖诱导表达,结果显示在0.2% ara+ LB平板明显的生长抑制。通过以上实验,我们确定204突变株分裂抑制形成丝状体的原因是由于yeeZ基因前210bp片段的表达所导致,根据文献分析,其机制可能是干扰了与YeeN相互作用关系,确切机制尚有待深入研究。通过本研究,我们确定了204突变株形成丝状体的原因,明确了yeeZ基因功能的重要性,其与分裂过程并非直接的作用关系,而是一个间接的作用。我们同时发现,突变的yeeZ基因对分裂的抑制,不仅仅表现在弗氏枸橼酸杆菌中,在大肠杆菌中也有存在。有鉴于yeeZ基因的插入突变导致细菌生长显著缓慢,大肠杆菌突变株甚至只能有限生长,类似机制可应用于相关细菌减毒疫苗的构建。

全文目录

英文缩写一览表  4-6
英文摘要  6-10
中文摘要  10-13
前言  13-16
第一章革兰阴性菌基因敲除载体pYG4 的构建  16-28
  实验材料  16-19
  实验方法  19-25
  实验结果  25-26
  讨论  26-28
第二章弗氏枸橼酸杆菌 204 突变株丝状体形成原因的分析研究  28-61
  实验材料  28-31
  第一节弗氏枸橼酸杆菌yeeZ 基因的敲除及形态观察  31-38
    实验方法  31-37
    实验结果与讨论  37-38
  第二节弗氏枸橼酸杆菌yeeZ、yeeY 双基因的敲除及双基因互补株的构建  38-46
    实验方法  39-41
    实验结果  41-45
    讨论  45-46
  第三节 204 突变株yeeZ 基因突变区域的分析及表达  46-61
    实验方法  46-52
    实验结果  52-58
    讨论  58-61
全文总结  61-62
致谢  62-63
参考文献  63-65
文献综述细菌分裂过程调控影响因素的研究进展  65-73
  参考文献  71-73
攻读硕士学位期间发表的文章  73

弗氏枸橼酸杆菌yeeZ基因插入突变导致细菌分裂抑制的机制研究

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