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微异养混合养下隐藏嗜酸菌DX1-1自养积累PHB基因表达差异及代谢机制研究

作　者: 刘可可
导　师: 夏金兰
学　校: 中南大学
专　业: 生物工程
关键词: PHB 混合养 Real-time PCR 隐藏性嗜酸菌
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


聚-β-羟基丁酸酯（poly-β-hydroxybutyrate,以下简称为PHB）是细胞内的一类生物聚酯,是制备“生物可降解塑料”的理想原料。隐藏嗜酸菌株DX1-1（CCTCC M208056）筛自有机质严重缺乏的酸性矿坑水中,是一种兼养性铁还原和硫氧化菌,具备累积体内PHB的能力。为了阐明培养条件对菌株DX1-1生长和PHB累积相关代谢途径的影响机制,开发菌株DX1-1在生长和PHB合成相关的有用基因资源,本文开展了如下研究工作：（1）比较研究了菌株DX1-1在自养（元素硫和/或硫酸铁）、异养（葡萄糖）、微异养（限制性葡萄糖+硫和/或硫酸铁）的混合养条件下的9K基础培养基中的生长和PHB累积情况；（2）克隆和分析了菌株DX1-1生长和PHB累积相关代谢系统功能基因；（3）采用Realtime PCR比较分析了菌株DX1-1在不同能源底物条件下生长和PHB累积相关功能基因的差异表达。取得如下研究结果。在异养条件下,菌株生长良好,能累积胞内PHB,在自养条件下,菌株不累积PHB,且生长较慢,其中在仅含铁（Ⅲ）为能源底物时不生长；在加入有限碳源,如0.1%的葡萄糖的混合养条件下,菌株无论在单质硫和/或硫酸铁的无机能源基质中,都能生长良好以及累积胞内PHB,且比相同限制性浓度的葡萄糖下的异养生长更快,PHB累积更多,在96 h时菌株DX1-1的细胞量为9.89×1 08个/mL,PHB产量为2.07g/L。在这些培养条件下,菌株DX1-1生长和生产PHB递减顺序为：GSF>GS>GF>G>>S,SF>>F（培养基名称参见表2-2）。克隆了菌株DX1-1的1个内标基因和26个生长与PHB累积相关代谢途径基因,分别为：6个PHB积累基因相关基因（包括一个表达相对稳定的基因）；10个二氧化碳固定相关基因；7个硫代谢相关基因；3个铁代谢相关基因。相关代谢基因Arcy3030（β-羟基丁酸聚合酶）,Arcy2759（聚β-羟基丁酸解聚酶）,Arcy0824（核酮糖二磷酸羧化酶）,Arcy0626（乙酰辅酶A合成酶）, Arcy1318（硫酸腺苷转移酶,亚基2）Arcy 2800（磷酸腺苷磷酸硫酸酯）,Arcy2799（亚硫酸盐还原酶p亚基）,Arcy0256（ABC型周质铁转运蛋白复合体）在限制性葡萄糖异养的混合养条件下较自养和异养条件均有明显上调。表明在0.1%的有限葡萄糖浓度的混合养情况下,细胞的PHB代谢相关基因更为活跃且利用了空气中的CO2进行了PHB的累积,意味着少量葡萄糖可以促进菌株DX1-1以自养方式积累PHB。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-10
第一章 绪论  10-21
  1.1 PHB及其应用  10-12
    1.1.1 PHB与传统塑料的优势比较  10-11
    1.1.2 PHB的各种应用  11-12
  1.2 PHB的生产  12-15
    1.2.1 PHB的一般发酵生产  12-13
    1.2.2 PHB的基因工程菌发酵生产  13-15
    1.2.3 PHB的植物生产  15
  1.3 PHB的研究进展及趋势  15-19
    1.3.1 国内的研究进展  15-16
    1.3.2 国外的研究进展  16-19
  1.4 A.cryptum DX1-1的特点及产PHB的优势  19
  1.5 本课题研究的目的及意义  19-20
  1.6 研究内容  20
  1.7 本论文课题资助情况  20-21
第二章 不同营养条件对A cryptum DX1-1生长及累积PHB的影响研究  21-30
  2.1 引言  21
  2.2 实验材料与方法  21-24
    2.2.1 主要仪器和设备  21
    2.2.2 菌种  21
    2.2.3 培养基  21-22
    2.2.4 测定方法  22-24
  2.3 结果与讨论  24-29
    2.3.1 电镜透射图下DX1-1累积PHB情况  24-25
    2.3.2 不同培养条件下DX1-1生长和PHB累积情况  25-29
  2.4 本章小结  29-30
第三章 A.cryptum DX1-1生长与PHB累积相关代谢途径关键基因的克隆与序列比对分析  30-42
  3.1 引言  30
  3.2 实验材料与方法  30-32
    3.2.1 主要仪器和设备  30
    3.2.2 总DNA的提取  30-31
    3.2.3 基因的PCR扩增及纯化  31
    3.2.4 基因的克隆及序列比对分析  31-32
  3.3 结果与讨论  32-40
    3.3.1 代谢相关基因的选择与引物设计  32-34
    3.3.2 代谢相关基因的PCR扩增电泳图  34-35
    3.3.3 代谢相关基因的克隆和阳性质粒菌体PCR产物电泳分析  35-36
    3.3.4 A.cryptum DX1-1相关代谢基因与同源基因相似度分析  36-38
    3.3.5 相关代谢基因片段与同源菌序列分析及氨基酸序列比对  38-40
  3.4 本章小结  40-42
第四章 不同营养条件下A.cryptum DX1-1生长与PHB累积相关功能基因差异表达分析  42-55
  4.1 引言  42
  4.2 实验材料与方法  42-46
    4.2.1 实验试剂  42
    4.2.2 总RNA提取  42-44
    4.2.3 逆转录mRNA  44
    4.2.4 RT-PCR  44-46
  4.3 结果与讨论  46-54
    4.3.1 总RNA分析  46-48
    4.3.2 Real-time PCR结果  48-52
    4.3.3 Realtime PCR结果讨论  52-54
  4.4 本章小结  54-55
第五章 全文总结  55-56
参考文献  56-62
致谢  62-63
攻读学位期间主要的研究成果  63

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物遗传学
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