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弗氏枸椽酸杆菌群集运动的分子机制研究

作　者: 丛延广
导　师: 徐启旺
学　校: 第三军医大学
专　业: 病原生物学
关键词: 弗氏枸橼酸杆菌群集运动分子机制转座诱变
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

群集运动(swarming motility)是指运动细菌以群体方式在培养基表面由接种点向周围进行的依赖鞭毛的迁移运动。其主要特征为：①与液体培养基中的泳动细胞比较，群集细胞会在形态、代谢、某些蛋白表达等方面发生显著的分化；②泳动是个体行为，而群集运动是群体行为，单个的细菌菌体是无法在相应的培养基表面做扩散运动的。对群集运动现象越来越广泛的研究过程中，不断有新的种属发现具有群集运动能力，以至认为这一现象是运动细菌的一种普遍现象。肠杆科细菌是引起尿道感染的主要病原，对变形杆菌的研究表明，其群集运动和分化的能力与致病性有关。枸橼酸杆菌属的细菌广泛分布于自然环境中，是人和动物肠道的正常菌群。本菌属为机会致病菌，主要出现在泌尿道和呼吸道感染中。有鞭毛，能运动。但在此之前，还从未有关该属细菌群集运动的报道和研究。初步的研究结果表明，枸橼酸杆菌的群集运动与变形杆菌相比有明显的差异，作为一种弱运动力细菌(与变形杆菌、弧菌等比较)，其群集运动分子机制的研究对该现象调节机制的全面认识有重要意义。我们选用弗氏枸橼酸杆菌代表株ATCC8090作为研究对象，建立了在平板表面群集运动和分化的模型，并用转座子诱导的办法广泛筛选群集运动突变株，通过对突变基因的定位分析来了解弗氏枸橼酸杆菌群集运动分子机制的概况，为深入认识群集运动的规律奠定基础。实验的主要内容和结果包括以下几个方面： 1．以弗氏枸橼酸杆菌代表株ATCC8090为研究对象，建立其在平板表面群集运动和分化的模型。研究发现，弗氏枸橼酸杆菌的群集运动能力较弱，平板的琼脂浓度范围只能在0.4％-0.7％之间；在营养上，单独胰胨或蛋白胨就可满足群集运动对碳源氮源的全部要求；酪蛋白水解物和无机铵盐作为氮源不支持群集运动；所有能利用的碳源都促进群集运动，以葡萄糖为最佳。根据研究结果，为统一实验条件，我们确定了一种适宜枸橼酸杆菌群集运动的SW培养基。 2．群集细胞表现出明显的分化现象，包括菌体变长、鞭毛密度增加、有氧呼吸被抑制、表面亲水性增强等，涉及鞭毛运动、菌体分裂、表面结构和代谢途径等方面的变化。第三军医大学博士学位论文 3.建立构椽酸杆菌的转座诱导方法。采用Mini一Tns Km转座子，转座方法为双亲本滤膜接合法。实验结果显示，转座效率可达每受体菌9.2 x10一6，有很好的转座随机性，_目_在染色体上的转座子序列可以稳定传代。 4.在4047株转座接合子中共筛选出85株群集运动突变株，初步分成两大类。第一类是在液体环境中不能泳动的突变株(swim一)，共有36株，进一步分成能够合成鞭毛蛋白的有16株和不合成鞭毛蛋白的有20株。第二类在液体环境中能够泳动的突变株(s wim+)有49株，其中泳动不正常的有14株，泳动正常的有35株。根据在泳动培养基表面的扩散程度，进一步将泳动正常株分成趋化阳性(18株)和趋化阴性(17株)两类。 5.为对突变株的插入突变基因进行定位分析，比较了三种PCR方法(SteP一outPCR，随机引物巢式PCR，反向PCR)，从扩增效率和特异性上分析，最后确定反向PCR是最适合本实验要求的方法。对反向PCR法，根据转座子基因序列特点，在本研究中省略了选择内切酶的步骤，直接采用Taql内切酶进行实验，使实验步骤简化。 6.测序和同源性基因分析结果表明，影响弗氏构椽酸杆菌群集运动的基因主要涉及编码鞭毛合成和能量传递、趋化、脂多糖、胞外多糖、某些代谢途径、某些调节蛋白的基因及其它部分未知基因。 7.研究发现脂多糖对群集运动的主要影响，并不是增加培养基表面的润滑程度，而是对细菌鞭毛的生物合成产生抑制，导致多数菌体不能运动，且容易聚集。 8.rcsC基因和yojN基因发生突变均会导致菌体表面亲水性的降低，从而影响群集运动。二者对鞭毛合成的调节不同于其它细菌，因此突变株不增加鞭毛的产生量 (resC突变株甚至有减少)，也不形成早熟的群集运动。而二者存在的差异显示，resC基因的产物除参与组氨酸一天门冬氨酸磷酸化传递系统外，很可能还参与有另外的调节途径。 9.B一酮酞基一酞基载体蛋白合酶11控制合成不饱和脂肪酸，能够影响质膜的流动性。我们发现，该酶的缺失还会影响细菌的群集运动能力。 10.四硫磺酸盐还原酶的缺失会影响细菌的群集运动。由于在培养基中没有四硫磺酸盐成分，这个影响不可能是通过对四硫磺酸盐的代谢活动产生的，提示该酶还有其它的未知功能。 11.两株参与胞外多糖合成的糖基转移酶突变株的群集运动能力有显著下降。但与脂多糖不同，胞外多糖的缺失并不影响突变株在液体条件下的泳动，也就是说，胞外多糖不影响鞭毛的合成，因此缺失不直接影响运动本身，而是影响细菌运动的环境第三军医大学博士学位论文条件，从而间接地抑制群集运动。 12.mviA基因编码一个重要的调节因子MviA，其缺失导致生长率显著降低，从而影响菌落生长和扩散程度。同时，突变株对酸、高渗、高热、高浓度过氧化氢也有较强的抵抗能力。 13.yqhC基因属于一种AraC一家族转录调控蛋白。该基因突变对群集运动

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英文缩写词表  4-6
英文摘要  6-10
中文摘要  10-13
论文正文弗氏枸椽酸杆菌群集运动的分子机制研究  13-75
  前言  13-15
  第一部分弗氏枸椽酸杆菌群集运动现象的基本特征  15-26
    材料与方法  15-18
    结果  18-23
    讨论  23-26
  第二部分弗氏枸椽酸杆菌转座诱导的方法学研究及突变株的初步分类  26-37
    材料与方法  26-32
    结果与讨论  32-37
  第三部分转座突变株插入失活基因的定位方法  37-45
    材料与方法  37-40
    结果与讨论  40-45
  第四部分测序定位结果及突变株生物学特征分析  45-67
    材料与方法  45-46
    结果  46-58
    讨论  58-67
  主要结论  67-69
  参考文献  69-75
文献综述细菌群集运动分子机制研究概况  75-84
  参考文献  79-84
附录: 弗氏枸橼酸杆菌群集运动突变株测序结果及局域相似性比对分析结果  84-116
致谢  116-117
攻读学位期间发表的文章  117

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