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甜菊苷的定向转化及产物甜茶苷的分离纯化

作　者: 姜中玉
导　师: 陈育如
学　校: 南京师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 甜菊苷 黄杆菌 甜茶苷 生物转化 胞内酶
分类号: S566.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


甜菊糖是从甜叶菊(Stevia rebaudiana bertoni)中提取的一种天然甜味剂,主要成分为甜菊苷(SS)和莱鲍迪甙A(RA)。甜茶苷(RS)是从高山植物甜茶中提取出来的天然甜味剂,产量低且受地域条件的限制,如果能用生物转化的方法将SS转化为RS,可为RS的生产提供全新的方法,减少因种植甜茶而带来的山地生态破坏。本工作筛选了一株能特异性转化甜菊苷为甜茶苷的细菌。结合菌体、菌落的形态特征及16S rDNA序列鉴定,确定其为黄杆菌(Chryseobacterium sp.,专利保藏号为CCTCC NO:M209202)。该菌能专一性对SS进行转化,而不作用于甜菊糖中的其他成分。经单因素试验,优化了该菌的培养条件,结果表明,木薯淀粉1%,蛋白胨1%,K2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.5%, NaCl 0.2%,硫酸镁0.04%是适宜的培养基成分,在pH7.0,37℃,50 mL/250 mL,接种量10%的条件下,48h可将10 mg/mL甜菊糖溶液中的甜菊苷(7.2 mg/mL)完全转化。该菌所产酶为胞内酶,采用高压破壁,在45℃,pH值7.0,底物浓度10 mg/mL的条件下,12h甜菊苷的转化率为95%,15 h可完全转化。用不同的表面活性剂对细胞进行破壁,当SDS添加量0.2%,12h转化率为90%,CTAB添加量1%时,12h转化率为74%,Triton-100添加2%,12h转化率达到100%。以海藻酸钠为包埋材料,对黄杆菌胞内酶进行固定化,在海藻酸钠浓度4%,氯化钙浓度2%,经2h的固定化,然后在45℃,pH7.0,在10 mLl%甜菊糖溶液中添加15g固定化酶,固定化酶可重复利用3次,转化效率保持在80%以上。用大孔树脂对RS进行分离纯化,研究表明,1体积的CN-308树脂可以完全吸附10倍体积转化液中的糖分。上样液为27.5BV时,RS与RA吸附饱和。用70%乙醇作为洗脱剂,洗脱液体积为1.5BV时,RS纯度为96%.

全文目录


摘要  3-4Abstract  4-6目录  6-9第一章 文献综述  9-16  1.1 甜菊苷概况  9-11  1.2 甜茶苷的研究概况  11-15    1.2.1 研究概述  11-13    1.2.2 甜茶苷的提取、分离纯化及检测  13-14    1.2.3 甜茶苷的功用  14-15  1.3 本文研究目的、意义及内容  15-16第二章 甜菊苷转化微生物的筛选与鉴定  16-27  2.1 材料与方法  16-18    2.1.1 材料与试剂  16-17    2.1.2 实验方法  17-18    2.1.3 仪器与设备  18  2.2 甜菊苷转化微生物的筛选与鉴定  18-22    2.2.1 转化微生物的筛选  18-20    2.2.2 JH菌的鉴定  20-22  2.3 JH菌对甜菊苷的转化及产物鉴定  22-25    2.3.1 JH菌对甜菊苷的转化  22-23    2.3.2 转化产物的鉴定  23-25  2.4 本章小结  25-27第三章 JH菌对甜菊苷的转化研究  27-33  3.1 材料与方法  27-28    3.1.1 材料与试剂  27-28    3.1.2 仪器与设备  28  3.2 培养基的优化  28-30    3.2.1 碳源对转化效果的影响  28-29    3.2.2 氮源对SS转化的影响  29    3.2.3 无机盐对SS转化的影响  29    3.2.4 活化培养基中SS添加量对SS转化的影响  29-30  3.3 菌液对SS转化条件探讨  30-32    3.3.1 不同的装液量对转化效果的影响  30    3.3.2 接种量对转化效果的影响  30-31    3.3.3 温度对转化效果的影响  31    3.3.4 起始pH值对转化效果的影响  31    3.3.5 底物浓度对SS转化的影响  31-32    3.3.6 最优条件下转化时间曲线  32  3.4 本章小结  32-33第四章 胞内酶对甜菊苷的转化研究  33-42  4.1 材料和方法  33-34    4.1.1 菌种与材料  33    4.1.2 实验方法  33-34    4.1.3 仪器和设备  34  4.2 转化SS酶的探讨  34-35    4.2.1 细胞,胞内、外液对SS的转化  34-35    4.2.2 培养基对胞内酶活性的影响  35  4.3 胞内酶转化特性研究  35-38    4.3.1 温度对转化效果的影响  36    4.3.2 pH对转化效果的影响  36    4.3.3 酶液量对转化效果的影响  36-37    4.3.4 底物浓度对转化效果的影响  37    4.3.5 最适条件下胞内酶转化效果的时间曲线  37-38  4.4 抗生素添加量的研究  38-39  4.5 细胞破壁的方法研究  39-41    4.5.1 胆酸钠破壁后对胞内酶转化效果的影响  39-40    4.5.2 SDS破壁后对胞内酶转化效果的影响  40    4.5.3 CTAB破壁后对胞内酶转化效果的影响  40-41  4.6 本章小结  41-42第五章 固定化酶对甜菊苷的转化研究  42-49  5.1 材料和方法  42-43    5.1.1 菌种与材料  42    5.1.2 实验方法  42-43    5.1.3 仪器和设备  43  5.2 海藻酸钠固定化酶制备条件优化  43-46    5.2.1 海藻酸钠浓度对酶转化效果的影响  43-44    5.2.2 不同酶液量与海藻酸钠溶液量之比对转化效果影响  44-45    5.2.3 氯化钙浓度对固定化酶转化效果的影响  45    5.2.4 固定化时间对固定化酶转化效果的影响  45-46  5.3 固定化酶转化条件探讨  46-48    5.3.1 温度对固定化酶转化效果的影响  46    5.3.2 pH对固定化酶转化效果的影响  46-47    5.3.3 固定化酶添加量对转化效果的影响  47    5.3.4 底物浓度对转化效果的影响  47-48    5.3.5 固定化酶的重复使用  48  5.4 本章小结  48-49第六章 大孔树脂对甜菊糖转化产物甜茶苷的分离纯化  49-54  6.1 材料与方法  49-50    6.1.1 材料与试剂  49    6.1.2 实验方法  49-50    6.1.3 仪器与设备  50  6.2 树脂的筛选  50-51    6.2.1 树脂的静态吸附  50-51    6.2.2 树脂的静态洗脱  51  6.3 树脂的分离纯化研究  51-53    6.3.1 树脂的动态吸附  52-53    6.3.2 树脂的动态洗脱  53  6.4 结论  53-54第七章 结论与展望  54-55  7.1 结论  54  7.2 展望  54-55附录  55-56  1 甜菊苷(SS)含量HPLC测定标准曲线  55  2 莱鲍迪甙A(RA)含量HPLC测定标准曲线  55-56参考文献  56-64论文及专利  64-65致谢  65

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 糖料作物 > 其他
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