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稻瘟病菌FJ81278中11个预测特异基因的功能分析

作　者: 王杏杏
导　师: 王宗华；王宝华
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理
关键词: 稻瘟病菌无毒基因特异基因分子标记
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

为了克隆稻瘟病菌菌株FJ81278中的无毒基因Avr-Pi1、Avr-Pi2、Avr-Pi4a,通过图位克隆技术将其定位在BAC克隆子805L15中,BAC克隆测序后,预测了该段序列可能编码的基因,通过与测序菌株70-15基因组序列比较,获得一些FJ81278菌株中的特异基因。本研究对其中的4个特异基因进行了功能分析。同时,分析了FJ81278菌株的基因组序列,对其中7个预测为信号肽的特异基因进行了功能研究。构建了上述11个特异基因,即MoUng01、MoUng02、MoUng03、MoUng04、MoUng05、MoUng06、MoUng07、MoUng08、MoUng09、MoUng10、MoUng11的过量表达载体,然后转入稻瘟病菌野生型菌株GUY11的原生质体获得这些特异基因过量表达转化子。将这些转化子通过分生孢子悬浮液活体喷雾接种CO39近等基因系水稻品种,分别是C101LAC Pi-1(t)、C101A51 Pi-2(t)、C104PKT Pi-3(t)、C101PKT Pi-4a和C105TTP-4L-23 Pi-4b。由实验结果得知,稻瘟病菌过量表达转化子与野生型菌株GUY11的致病性是一致的,推测无毒基因Avr-Pi1、Avr-Pi2和Avr-Pi4a不存在于这些特异基因中,或者这些特异基因含有这三个无毒基因但不能正常表达。对这些稻瘟病菌突变体其他表型的分析结果却显示,MoUng05、MoUng03、MoUng07的过量表达(OE)转化子产孢量上升,而MoUng04、MoUng06却反之;特异基因MoUng01、MoUng09的过量表达转化子对洋葱表皮侵染能力有所下降而对水稻的致病力没有发生改变。多个分子标记将无毒基因Avr-Pi1、Avr-Pi2和Avr-Pi4a定位于BAC克隆805L15中。但本实验的结果表明,来源于该BAC克隆的4个特异性基因并非是这三个无毒基因。实验室前期采用同样的方法,排除了该BAC克隆中其它预测基因作为这些无毒基因的可能。我们分析造成这个结果的原因可能是当初BAC克隆805L15的序列拼接有误。因此,本研究最后用Southern杂交的方法分析了805L15克隆的拼接情况,证实了该BAC克隆序列拼接有误。今后应该完善805L15克隆的拼接,对获得的序列重新进行基因预测,分析FJ81278菌株中特异基因的功能,以期最后获得无毒基因Avr-Pi1、Avr-Pi2和Avr-Pi4a。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-9
1 前言  9-20
  1.1 稻瘟病无毒基因的研究  10-18
    1.1.1 无毒基因的克隆  10-14
    1.1.2 无毒基因的功能  14-15
    1.1.3 无毒基因与抗病基因的互作模式  15-17
    1.1.4 研究无毒基因的意义  17-18
  1.2 预测特异基因的功能分析在81278 无毒基因研究中的意义  18-20
    1.2.1 特异基因与无毒基因的关系  18
    1.2.2 FJ81278 中无毒基因簇Avr-Pi1、Avr-Pi2 和Avr-Pi4a 的定位  18-20
2 材料与方法  20-41
  2.1 供试菌株、水稻品种及载体质粒  20-21
    2.1.1 供试菌株  20
    2.1.2 实验所用水稻品种  20
    2.1.3 供试载体质粒  20-21
  2.2 研究方法  21-41
    2.2.1 致病性测定  21-23
    2.2.2 培养基  23-24
    2.2.3 稻瘟病菌基因组DNA 的提取  24-25
    2.2.4 小量质粒DNA 的制备  25
    2.2.5 小量制备BAC DNA  25-26
    2.2.6 PCR 扩增及其产物的电泳检测  26
    2.2.7 PCR 产物的克隆  26
    2.2.8 制备E.coli DH_(5α)感受态细胞  26-27
    2.2.9 细菌转化  27
    2.2.10 过量表达载体的构建  27-29
    2.2.11 酵母同源重组  29-31
    2.2.12 稻瘟病菌的遗传转化  31-32
    2.2.13 稻瘟病菌菌丝Total RNA 的提取及检测  32-34
    2.2.14 RT-PCR 反转录  34-35
    2.2.15 稻瘟病菌表型观察  35
    2.2.16 Southern 杂交  35-41
3 结果与分析  41-59
  3.1 81278 中11 个预测特异基因的生物信息学分析  41-42
  3.2 特异基因的过量表达  42-54
    3.2.1 特异基因过量表达载体的构建  42-44
    3.2.2 特异基因的稻瘟病菌阳性转化子的获得及其验证  44-46
    3.2.3 过量表达转化子的表型分析  46-51
    3.2.4 过量表达稻瘟病菌转化子致病性分析  51-54
  3.3 BAC 克隆子805L15 序列拼接的完整性验证  54-58
  3.4 后代亲本菌株的杂交分析  58-59
4 结论与讨论  59-61
  4.1 11 个预测特异基因OE 转化子的表型分析  59
  4.2 11 个预测特异基因的功能与无毒基因无关  59
  4.3 BAC 克隆子805L15 的拼接完善性  59-60
  4.4 FJ81278 基因组序列中特异基因的预测与筛选  60-61
参考文献  61-67
附录  67-68
致谢  68

稻瘟病菌FJ81278中11个预测特异基因的功能分析

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