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用HPLC法建立SPT抑制剂筛选模型的研究

作　者: 林楠
导　师: 陈仕江
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中药生药学
关键词: 丝氨酸棕榈酰转移酶 SPT抑制剂高效液相色谱多球壳菌素
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)[EC2.3.1.50]是体内鞘脂合成的关键酶,在调节鞘脂代谢中起着枢纽作用,影响各种鞘脂类成分在体内的合成、分布及功能,蝉花(Cordyceps cicadae)是我国传统的一种名贵中药,与冬虫夏草同属虫菌复合体,其主要的活性成分多球壳菌素(myriocin, ISP-1)是SPT的天然抑制剂,具有较强的免疫抑制活性,还具有抗动脉粥样硬化、抗真菌等药理作用,这些活性可能通过调节同一靶点—SPT,寻找SPT更优的抑制剂具有广阔的临床价值,为此本文建立一种操作简便、精密度和准确性高的SPT抑制剂筛选平台,为抑制剂的筛选实验提供可能的技术手段,也为进一步的研究奠定基础。方法：大鼠肺脏中SPT活性较高,本文以大鼠肺脏为酶源,超声粉碎,冷冻离心,制备含酶裂解液,与底物反应后,加入内标物,液液萃取酶反应产物,HPLC测定酶反应含量,从而建立抑制剂筛选平台,通过内标法计算抑制率,评价抑制效果。实验优化裂解,萃取,酶反应等各个步骤的实验条件,为此,还建立了邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生-HPLC-UV的测定方法,考察了衍生化反应体系中缓冲盐浓度和pH、OPA量、2-巯基乙醇量、衍生反应时间、衍生反应温度等因素对二氢鞘鞍醇(Sa.酶产物)和植物鞘鞍醇(Phy.内标物)长链碱衍生物影响及稳定性。在酶反应体系中加入myriocin标准品,测试平台的可行性,而后通过加入几种不同的中药提取物,进行了初步的筛选实验。结果：柱前衍生在25℃反应2h为优化的反应条件,检测波长为230nm,二氢鞘鞍醇和植物鞘鞍醇样品衍生产物在放置4℃冰箱7h内稳定,测定结果的RSD均小于4.0%,二氢鞘鞍醇线性范围为3.125—100.0μg／mL(r=0.9993)、植物鞘鞍醇衍生物线性范围为5.0—500.0μg／mL(r=0.9971)；检测限(S／N=3：1)：Phy为0.9μg／mL,Sa为0.5μg／mL。超声裂解大鼠肺脏制备的酶裂解液,裂解均匀,蛋白含量稳定,通过优化萃取过程,不同条件下的萃取率保持在70.0%到85.0%之间,上清液量为90μL,高液进样量40μL(底物浓度为：L-丝氨酸(200 mM),棕榈酰辅酶A(5 mM))为优化的酶反应条件,在抑制剂筛选试验中,除禅花菌丝体提取物抑制率为69.20%,其它中药提取物没有明显的抑制作用。结论：实验建立了检测SPT反应产物的高效液相色谱法,在此基础上建立了SPT抑制剂体外筛选模型,应用本方法对4种中药提取物进行了检测,没有发现对SPT有明显抑制作用的提取物,今后可加大筛选力度,以期找到更优的抑制剂。本研究在参考国外文献的基础上,在国内首次建立一种灵敏度高、成本低、方便一般实验室操作的SPT抑制剂筛选模型,与通常的同位素标记法比较,具有设备简单,没有放射性危险等优点。大力开展筛选新的丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂具有广阔的前景,尤其是从中药中发现明显效果的抑制剂具有良好的理论价值和经济价值。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
中英文对照表  9-10
第一章文献综述  10-23
  引言  10
  1.1 鞘酯的结构和生源代谢途径  10-13
    1.1.1 鞘酯类结构  10-12
    1.1.2 鞘酯的生源代谢途径  12-13
  1.2 丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)的研究  13-19
    1.2.1 SPT的早期研究历史  13
    1.2.2 从头合成的鞘脂依靠SPT  13-14
    1.2.3 SPT基因和分子结构  14
    1.2.4 SPT是一个5'磷酸吡哆醛依赖酶的亚族成员  14-15
    1.2.5 SPT反应机制  15
    1.2.6 SPT底物特异性  15-16
    1.2.7 SPT和基因遗传病  16
    1.2.8 SPT的活性调控  16-19
    1.2.9 SPT未来研究方向  19
  1.3 SPT抑制剂  19-20
    1.3.1 SPT的抑制剂  19
    1.3.2 SPT的抑制剂多球鞘菌素(myriocin,ISP-1)  19-20
  1.4 HPLC测定SPT活性法  20-21
  1.5 论文的主要研究内容和先进性  21-23
    1.5.1 研究内容  21-22
    1.5.2 先进性  22-23
第二章柱前衍生化高效液相色谱测定法的建立  23-37
  2.1 前言  23
  2.2 材料和方法  23-25
    2.2.1 试药、试剂与材料  23-24
    2.2.2 仪器与设备  24
    2.2.3 溶液的配制及样品的制备  24-25
    2.2.4 衍生化反应  25
    2.2.5 色谱条件  25
    2.2.6 液质条件  25
  2.3 结果  25-26
  2.4 讨论  26-37
    2.4.1 色谱条件的优化  26
    2.4.2 衍生条件的优化  26-29
    2.4.3 测定波长的选择  29-31
    2.4.4 紫外和荧光检测器灵敏度的比较  31
    2.4.5 衍生产物的确认  31-33
    2.4.6 方法学验证  33-37
第三章酶源制备及粗蛋白的测定  37-43
  3.1 前言  37
  3.2 材料和方法  37-39
    3.2.1 试药、试剂与材料  37
    3.2.2 仪器  37-38
    3.2.3 溶液的配制及样品的制备  38-39
    3.2.4 粗蛋白含量的检测  39
  3.3 结果  39-40
  3.4 讨论  40-43
    3.4.1 蛋白质含量测定方法选用  40
    3.4.2 酶源的选择  40
    3.4.3 粉碎方式对蛋白质含量的影响  40-41
    3.4.4 含量的稳定性试验  41-42
    3.4.5 含酶裂解液的配置方案  42-43
第四章液液萃取方法的建立  43-50
  4.1 前言  43
  4.2 材料和方法  43-45
    4.2.1 试药、试剂与材料  43-44
    4.2.2 仪器  44
    4.2.3 溶液的配制及样品的制备  44
    4.2.4 液液萃取内标  44-45
  4.3 结果  45
  4.4 讨论  45-50
    4.4.1 萃取效果  45-46
    4.4.2 萃取次数  46-47
    4.4.3 不同蛋白含量裂解液的破乳萃取条件  47-48
    4.4.4 高低两种含量内标的萃取率  48-50
第五章筛选平台的初步建立  50-59
  5.1 前言  50
  5.2 材料和方法  50-53
    5.2.1 试药、试剂与材料  50-51
    5.2.2 仪器  51-52
    5.2.3 溶液的配制及样品的制备  52-53
    5.2.4 筛选平台的初步建立  53
  5.3 结果  53-54
  5.4 讨论  54-59
    5.4.1 测定平台的建立  54-55
    5.4.2 底物浓度选择  55
    5.4.3 中药筛选物  55-56
    5.4.4 筛选实验结果  56-59
展望  59-60
参考文献  60-67
致谢  67-68
个人简历  68

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