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解偶联蛋白2在结肠癌发生发展中的作用研究

作　者: 蒯筱漪
导　师: 张红杰
学　校: 南京医科大学
专　业: 内科学
关键词: 解偶联蛋白2 结肠癌 Warburg效应糖酵解关键酶
分类号: R735.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

结肠癌是威胁人类健康的恶性肿瘤之一。目前结肠癌的病因及发病机制尚不完全明确。解偶联蛋白2(uncoupling protein-2, UCP2)是线粒体内膜蛋白,具有负调节活性氧簇(reactiveoxygen species, ROS)产生的作用。研究表明UCP2过表达与肿瘤适应性机制的形成有关。肿瘤适应性机制即细胞在不利微环境(如氧化应激压力,化学药物应用)中通过减少细胞凋亡,促进增殖,细胞获得永生化,最终导致肿瘤的生成与发展。适应性机制的形成可能与Warburg效应的发生有关。Warburg效应指肿瘤细胞的能量代谢途径由正常的氧化磷酸化变成以高度活跃的糖酵解为主的供能方式。近期研究发现,UCP2可以促进Warburg效应的形成。Warburg效应在恶性肿瘤中普遍存在。高度活跃的糖酵解是恶性肿瘤细胞区别正常组织细胞的独特代谢特征。目前认为糖酵解通路中的己糖激酶(hexokinase, HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脱氢酶(LDH),丙酮酸激酶(TuM-PK)等关键酶的活性或表达发生改变是肿瘤普遍存在Warburg效应的可能机制之一。另有研究表明UCP2在结肠癌中呈高表达,然而目前UCP2在结肠癌的发生发展中的作用尚不明确,本研究将着重对结肠癌组织中UCP2的高表达与临床病理学特征及预后之间的关系进行探讨。并在此基础上,从体外细胞实验进一步研究在结肠癌Warburg效应形成中UCP2是否通过影响糖酵解关键酶表达水平而发挥作用。【目的】:1.检测临床结肠癌组织标本中UCP2的表达及分布,并分析其与临床病理学改变间的关系及其临床意义。2.检测临床组织标本中UCP2与糖酵解关键酶,分析UCP2在结肠癌中与糖酵解关键酶之间存在的相互关系。3.并通过体外细胞实验研究,进一步研究UCP2对糖酵解关键酶表达的影响及其在促进结肠癌Warburg效应形成中作用。【方法】:1.免疫组织化学方法检测结肠癌患者(n = 78)、结肠腺瘤(n = 20)、结肠增生性息肉(n = 10)及正常结肠组织(n = 10)中UCP2的分布,并分析UCP2的表达情况与临床病理学间的关系及临床意义。2.定量PCR及Western blot方法检测癌旁及结肠癌组织(n = 15)中UCP2的表达。3.选取结肠癌Caco2细胞分别予以转染UCP2-siRNA,转染随机序列,同时设立空白对照,在培养12 h,24 h,36 h,48 h,60 h,72 h时,MTT法测定上述细胞增殖。4.结肠癌Caco2细胞分别予以转染UCP2- siRNA及随机序列后加入5-FU诱导凋亡,同时设立空白对照,培养24 h后流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。5.免疫组化方法分别检测结肠癌组织(n=15)、结肠腺瘤组织(n = 10)、及正常结肠组织(n = 10)中UCP2、LDH5、HKII、PFKFB3、TuM2-PK的表达。6.选取结肠癌Caco2细胞分别予以转染UCP2-siRNA,转染随机序列,同时设立空白对照,常规培养72 h,分光光度法测定培养上清液中乳酸浓度7.选取结肠癌Caco2细胞分别予以转染UCP2-siRNA,转染随机序列,同时设立空白对照,常规培养72 h,半定量RT-PCR及Western blot分别检测糖酵解相关基因mRNA及蛋白的表达。【结果】:1. UCP2 mRNA在肿瘤组织中的表达量约是癌旁组织的4倍,UCP2蛋白在肿瘤组织中的表达量约是癌旁组织的3倍。2. UCP2在结肠癌组织中阳性染色率高且强,在结肠腺瘤组织中也有一定量的表达。UCP2在结肠癌组织和正常组织之间的表达均具有明显的差异性(P < 0.01),而在结肠癌与腺瘤组织之间的表达无显著性差异(P > 0.05)。3. UCP2的表达量在临床分为Ⅲ和Ⅳ期的结肠癌组织中明显高于I和II期,UCP2在有转移患者中的阳性表达率高于无转移患者。4.转染UCP2-siRNA实验组UCP2表达较转染空质粒组及未处理组的UCP2明达明显下降。5.转染UCP2-siRNA实验组细胞生长速度较对照组及未处理组细胞减慢,有统计学差异(P < 0.05)。6.转染UCP2-siRNA实验组Caco2细胞在相同浓度5-FU诱导下凋亡较对照组明显增多(P < 0.05)。7.免疫组化检测结肠组织中糖酵解四种关键酶表达发现:LDH5及HKII在结肠癌组织和正常组织之间的阳性表达率均有显著性差异(P < 0.01),与UCP2在结肠癌组织中的表达有一定相关性。PFKFB3及TuM2-PK在结肠癌组织与正常组织之间的表达无显著性差异(P > 0.05)。在本实验中此四种酶在结肠癌组织与腺瘤组织之间的表达无显著性差异。8.转染UCP2-siRNA实验组细胞上清液乳酸浓度较对照组及未处理组细胞明显减少,有统计学差异(P < 0.05)。9.转染UCP2-siRNA实验组细胞LDH5 mRNA及蛋白表达较转染空质粒组及未处理组明显减低(P < 0.05),而HK-II mRNA及蛋白表达较转染空质粒组及未处理组蛋白表达无差异(P >0.05)。【结论】:1. UCP2在人结肠癌组织中高表达, UCP2的表达与肿瘤的转移及临床分期有关。2. LDH5及HKII在结肠癌组织及正常组织之间的表达具有显著性差异,提示肿瘤组织的特异性糖酵解的代谢方式很可能是通过此两种酶的活性及表达的改变而发生,相关机制需待进一步研究。3.本研究中,结肠癌细胞瞬时转染干扰UCP2表达后,结肠癌Caco2细胞增殖减慢,细胞凋亡增多。4.抑制UCP2表达,可降低乳酸水平且LDH5基因的表达下调,提示UCP2在促进结肠癌Warburg效应形成中,与糖酵解关键酶LDH5表达水平有关。

全文目录

中英文缩略词对照表  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-16
  参考文献  14-16
第一部分线粒体解偶联蛋白2在结肠癌中的表达及其临床意义  16-32
  材料和方法  16-23
  结果  23-28
  讨论  28-30
  参考文献  30-32
第二部分 UCP2 在结肠癌 Warburg 效应形成中的作用  32-62
  材料和方法  32-46
  结果  46-54
  讨论  54-58
  参考文献  58-62
结论  62-63
综述  63-70
  参考文献  67-70
攻读学位期间情况  70-71
致谢  71

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