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番茄线粒体解偶联蛋白基因（LeUCP）沉默对番茄光合作用、呼吸作用及抗逆性的影响

作　者: 刘自梅
导　师: 喻景权
学　校: 浙江大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 番茄 解偶联蛋白 光合作用 呼吸作用 逆境响应 氧化还原信号 活性氧
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


植物线粒体是进行呼吸作用为细胞提供能量的重要场所,其在感知外界逆境信号,调控植物抗逆防御反应中也扮演着重要的角色。植物线粒体对氧化胁迫的消除机制除存在交替氧化酶为末端氧化酶的交替电子传递链路径外,还可以通过线粒体解偶联蛋白UCPs来减弱活性氧的产生。研究发现,AtUCPl基因对低温、干旱等氧化胁迫抗性以及有效的光合作用均起着积极的作用。然而其对蔬菜作物的调节及在抗逆中的作用机制尚不清楚。因此,研究UCPs基因在调节植物光合、呼吸作用及在抗逆反应中的作用机制无疑具有非常重要的科学和现实意义。本文以烟草脆裂病毒(TRV)和番茄为材料,选择八氢番茄红素去饱和酶基因(PDS)作为参照基因,构建了TRV-LePDS和TRV-LeUCP重组质粒,建立了LePDS和LeUCP基因VIGS体系,LePDS基因沉默植株的叶片出现典型的光漂白现象；LeUCP基因沉默植株其基因表达量显著降低。利用TRV-LeUCP基因沉默植株,研究了番茄LeUCP基因对光合参数以及相关酶活性、荧光参数、电子流分配的影响,分析了LeUCP基因对线粒体呼吸、活性氧积累、交替氧化酶的影响。结合三羧酸循环中的顺乌头酸酶活性和柠檬酸含量及氧化还原状态以的变化,探明线粒体解偶联蛋白对Redox状态的影响。在PQ和高温逆境条件下,探明线粒体解偶联蛋白在氧化胁迫下是否起到保护作用。所得主要结果如下：1、研究了番茄LeUCP基因沉默对光合作用的影响。结果表明,TRV病毒载体侵染未引起番茄植株生长表型差异；基因沉默植株叶片在不同光照强度下的光合速率均低于对照植株,Pn、4sat、Vc，max值降低,气孔导度Gs提高,但对Ci无明显影响。番茄LeUCP基因沉默植株Rubisco和FBPase酶活性受抑制,分别降低了23.3%和20.3%。2、研究了番茄LeUCP基因沉默对叶绿素荧光参数的影响。LeUCP基因表达量的降低对Fv/Fm无明显影响,但降低了光化学猝灭系数(qP)和电子传递速率ETR,与Mock处理植株相比qP值降低了54%。提高了非光化学猝灭系数NPQ,并且明显降低了Je(PSII)和分配于Je(PCR)与Je(PCO)的比例以及NAD+/NADH比值。说明LeUCP基因编码的线粒体解偶联蛋白对有效的光合是必需的,可能通过影响卡尔文循环关键酶、重新分配PSII的电子流比例、降低电子传递速率和光呼吸而起作用。3、研究了番茄LeUCP基因沉默对呼吸作用和Redox状态的影响。基因沉默植株线粒体总呼吸和交替呼吸下降明显,抑制AOXl基因家族的基因表达,其中对AOXla基因表达量影响显著。LeUCP基因表达量的降低影响还原态泛醌的含量和丙酮酸含量,分别较Mock下降了54.3%和29.1%,表明线粒体交替氧化酶和解偶联蛋白两者呈协同表达关系。三羧酸循环中的顺乌头酸酶活性和柠檬酸含量与Mock相比分别降低34.6%、14.4%。NADH含量增加且NAD+/NADH明显下降,表明线粒体解偶联蛋白对维持Redox状态起一定作用。4、研究了PQ和高温氧化胁迫下解偶联蛋白基因的响应。与Mock和TRV组植株相比,LeUCP基因沉默诱导了植株叶片H2O2和O2.-的积累,并且在PQ和高温胁迫处理下,ROS积累显著增加,其中PQ处理后H2O2和O2.-分别较Mock增加44.67%和23%。PQ胁迫后造成了严重的氧化胁迫,Fv/Fm明显下降,MDA含量增加。CAT1、CAT2、SOD、cAPX、GR、POD基因表达量提高,但TRV-LeUCP+PQ仍然低于Mock+PQ与TRV+PQ。与Mock相比,PQ处理植株提高了AsA、GSH的含量,并且AsA/DHA、GSH+GSSG也有所增加,但TRV-LeUCP+PQ处理植株叶片AsA含量和GSH含量均低于Mock+PQ与TRV+PQ处理,进一步表明LeUCP对维持Redox信号平衡和增强氧化胁迫抗性具有重要作用。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-11
缩略词表  11-13
目录  13-17
1 引言  17-27
  1.1 病毒诱导的基因沉默(VIGS)  17-21
    1.1.1 VIGS的发现与发展  18
    1.1.2 VIGS的作用机制  18-19
    1.1.3 VIGS在植物基因功能研究中的原理与应用  19
    1.1.4 影响VIGS沉默效率的因素  19-21
    1.1.5 VIGS技术的优缺点  21
  1.2 植物线粒体解偶联蛋白  21-26
    1.2.1 解偶联蛋白的发现历程  22
    1.2.2 解偶联蛋白的结构、基因表达与分布  22-23
    1.2.3 解偶联蛋白的解偶联机制  23-24
    1.2.4 线粒体活性氧的产生  24-25
    1.2.5 线粒体解偶联蛋白在增强植物抵御逆境胁迫中的作用  25
    1.2.6 植物解偶联蛋白与交替氧化酶的相互关系  25-26
  1.3 本文的研究目的和意义  26-27
2 番茄LePDS与LeUCP基因沉默(VIGS)体系的建立  27-43
  2.1 材料与试剂  27-29
    2.1.1 植物材料  27
    2.1.2 菌株与质粒  27
    2.1.3 酶及试剂  27-28
    2.1.4 引物序列  28
    2.1.5 常用试剂配制  28-29
  2.2 实验方法  29-34
    2.2.1 番茄叶片总RNA提取、纯化和cDNA合成  29
    2.2.2 番茄LePDS、LeUCP cDAN片段PCR扩增  29-30
    2.2.3 DNA片段的电泳纯化回收  30-31
    2.2.4 回收DNA片段与pGEM-T easy载体连接  31
    2.2.5 大肠杆菌DH5a感受态的制备及连接产物的转化  31-32
    2.2.6 序列测定及分析  32
    2.2.7 质粒DNA提取  32-33
    2.2.8 质粒酶切鉴定  33
    2.2.9 农杆菌GV3101电转化感受态细胞的制备及电转化  33-34
    2.2.10 番茄幼苗VIGS侵染方法  34
  2.3 结果与分析  34-41
    2.3.1 番茄LePDS、LeUCP基因PCR扩增  34-35
    2.3.2 目的基因片段与pGEM-T easy的连接与测序鉴定  35-37
    2.3.3 含目的基因片段pGEM-T easy质粒酶切回收与鉴定  37
    2.3.4 病毒载体TRV-LePDS、TRV-LeUCP构建  37-40
    2.3.5 番茄LePDS基因沉默植株表型观察  40
    2.3.6 番茄植株LePDS基因沉默效率  40-41
  2.4 讨论  41-43
3 番茄线粒体解偶联蛋白基因(LeUCP)沉默植株鉴定及其对番茄光合作用的影响  43-56
  3.1 材料培养与试验设计  43-44
  3.2 试验方法  44-46
    3.2.1 总RNA提取、纯化和cDNA合成  44
    3.2.2 生物量的测定  44
    3.2.3 光合气体交换与叶绿素荧光测定  44
    3.2.4 Rubisco活性的测定  44-45
    3.2.5 FBPase活性的测定  45
    3.2.6 PSⅡ光化学量子效率(ΦPSⅡ)和碳同化量子产量(ΦCO_2) 的测定  45
    3.2.7 其它电子流的计算  45-46
    3.2.8 叶绿素荧光成像分析  46
  3.3 结果与分析  46-53
    3.3.1 番茄LeUCP基因沉默对番茄植株的表观、地上部与根系生物量的影响  46-47
    3.3.2 病毒TRV的分子检测  47-48
    3.3.3 番茄LeUCP基因沉默植株的鉴定  48
    3.3.4 番茄LeUCP基因沉默对光合作用光响应曲线的影响  48-49
    3.3.5 番茄LeUCP基因沉默对光合参数的影响  49-51
    3.3.6 番茄LeUCP基因沉默对Rubisco及FBPase活性的影响  51
    3.3.7 番茄LeUCP基因沉默对叶绿素荧光参数的影响  51-52
    3.3.8 番茄LeUCP基因沉默对电子流分配的影响  52-53
  3.4 讨论  53-56
4 番茄线粒体解偶联蛋白基因(LeUCP)沉默对番茄呼吸作用及抗逆性的影响  56-80
  4.1 材料培养和试验设计  56-57
    4.1.1 材料培养  57
    4.1.2 试验设计  57
  4.2 试验方法  57-63
    4.2.1 总RNA提取、纯化和cDNA合成  57-58
    4.2.2 呼吸速率的测定  58
    4.2.3 细胞色素氧化酶活性的测定  58-59
    4.2.4 丙酮酸含量的测定  59
    4.2.5 泛醌库氧化还原状态的测定  59
    4.2.6 线粒体顺乌头酸酶含量的测定  59-60
    4.2.7 柠檬酸含量的测定  60
    4.2.8 NADH及NAD~+的测定  60
    4.2.9 H_2O_2含量测定  60-61
    4.2.10 H_2O_2和O_2~(.-)组织化学染色  61
    4.2.11 叶片O_2~(.-)产生速率的检测  61
    4.2.12 叶绿素荧光成像分析  61-62
    4.2.13 丙二醛(MDA)含量的测定  62
    4.2.14 抗氧化酶活性的测定  62-63
    4.2.15 AsA和DHA含量和谷胱甘肽含量的测定  63
  4.3 结果与分析  63-77
    4.3.1 番茄LeUCP基因沉默对呼吸作用的影响  63-64
    4.3.2 番茄LeUCP基因沉默对细胞色素氧化酶及其基因表达的影响  64-65
    4.3.3 番茄LeUCP基因沉默对交替氧化酶基因表达的影响  65-66
    4.3.4 番茄LeUCP基因沉默对泛醌库和丙酮酸含量的影响  66
    4.3.5 番茄LeUCP基因沉默对线粒体顺乌头酸酶活性和柠檬酸含量的影响  66-67
    4.3.6 番茄LeUCP基因沉默对NADH含量及其氧化还原状态的影响  67-68
    4.3.7 PQ对番茄LeUCP基因表达量的影响  68-69
    4.3.8 番茄LeUCP基因介导PQ对H_2O_2含量的影响  69
    4.3.9 番茄LeUCP基因介导PQ对O_2~(.-)含量的影响  69-71
    4.3.10 番茄LeUCP基因介导番茄对PQ抗性的调控  71
    4.3.11 番茄LeUCP基因介导PQ对MDA的影响  71-72
    4.3.12 番茄LeUCP基因介导PQ对抗氧化酶活性的影响  72-74
    4.3.13 番茄LeUCP基因介导PQ对番茄抗坏血酸和谷胱甘肽含量的影响  74-75
    4.3.14 番茄LeUCP基因介导高温对H_2O_2和O_2~-含量的影响  75-77
  4.4 讨论  77-80
5 结论  80-81
参考文献  81-91
个人简历及发表文章  91

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 茄果类 > 番茄（西红柿）
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