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Rv1984c和ESAT-6的原核表达及其和其他抗原组合在结核病血清诊断中的应用研究

作　者: 闫晓晓
导　师: 李名扬；张舒林
学　校: 西南大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 结核分枝杆菌 pET28a-Rv1984c pET30a-ESAT-6 ESAT-6-CFP-10-16KD 抗原血清学检测
分类号: R52
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

结核病(tuberculosis,TB)是目前传染病的头号杀手。我国在全球22个TB高负担国家中居2位。目前常用的结核病诊断方法,主要依靠痰涂片、细菌培养、结核菌素(PPD)等检测技术,耗时长,敏感度和特异性低,常常导致漏诊和误诊,从而延误了和治疗时机,也给病人带来巨大的经济负担。因此,建立快速,敏感,简便的早期诊断方法是目前国内外检测结核病继续解决的问题。因此寻找到结核分支杆菌的特异性抗原,对于结核病的诊断具有重要意义免疫诊断作为其防控的早期诊断技术之一,近年来得到更加广泛的关注。而结核分枝杆菌RD区编码蛋白的发现,促进了结核病免疫诊断的迅速发展。酶联免疫吸附实验(ELISA)简单、快速、易于操作、又不需特殊精密仪器,由于该检测方法具有被广泛应用于临床检验以及科学研究中。将酶的高效催化作用和抗原或抗体的免疫方法结合起来,对抗原抗体反应级联放大,再经酶分解底物显色,敏感地检测血清中微量的特异性抗原或抗体。将优势抗原和酶联免疫吸附实验结合起来,建立起快速、简便、准确的血清学免疫诊断法受到越来越多的关注本文选取RD区编码的基因esat-6和Rv1984,利用PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv株扩增出目的片段,并将其分别克隆到表达载体pET30a和pET28a中,构建重组表达质粒并转化到E.coil BL21(DE3)表达菌株,经IPTG诱导表达后,用SDS-PAGE进行分析,选最佳的表达条件和可溶性分析。用纯化后的Rv1984c、ESAT-6和ESAT-6-CFP-10-16KD重组蛋白做为包被抗原,对结核病人进行血清免疫学检测。探讨单个抗原和混合抗原对结核病诊断的敏感性和特异性,为进一步结核病诊断试剂盒的研发提供依据。结果：1.用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv国际标准株中扩增出目的基因Rv1984c和esat-6基因大小与目的基因大小一样,分别为576bp和288bp；构建的重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定,经NCBI比对后,符合率都达到100%；2.重组工程菌pET28a-Rv1984c和pET30a-ESAT-6,分子量分别为23KD和17.1KD。pET28a-Rv1984c在25℃,终浓度为1mM IPTG诱导6h时表达量最多；pET30a-ESAT-6在25℃,终浓度为1mM IPTG诱导4h时表达量最多,之后随着诱导时间的增加,表达量逐渐下降。3.重组工程菌pET28a-Rv1984c超声破碎后,经SDS-PAGE分析为包涵体表达,经半透膜透析复性后为可溶性表达；重组工程菌pET30a-esat-6超声破碎后,经SDS-PAGE分析为可溶性表达；4.pET28a-Rv1984c和pET30a-esat-6经Ni-NTA亲和纯化后分别获得纯度为97.4%和51.2%的重组蛋白。5.重组蛋白pET28a-Rv1984c和pET30a-ESAT-6、ESAT-6-CFP-10-16KD为包被抗原建立间接ELISA法,结核病患者、非结核呼吸系统疾病患者和健康人群血清。结果显示,灵敏度分别为46.8%,70.21%和88.37%,特异性分别为76.71%,90.4%和97.4%,交叉反应率10%,40%和15%。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
1 综述  10-18
  1.1 结核病的现状  10-11
  1.2 国内外结核病研究现状  11
  1.3 结核病的诊断现状  11-17
    1.3.1 细菌学诊断现状  11-12
    1.3.2 分子生物学诊断现状  12-14
    1.3.3 结核病免疫学诊断方法  14-17
  1.4 展望  17-18
2 结核分枝杆菌Rv1984c基因的原核表达  18-34
  2.1 引言  18
  2.2 实验流程  18
  2.3 主要材料和试剂  18-21
    2.3.1 材料和方法  18-20
    2.3.2 主要仪器  20-21
  2.4 实验方法  21-28
    2.4.1 目的基因的制备  21-23
    2.4.2 重组质粒构建  23-24
    2.4.3 重组质粒鉴定  24-25
    2.4.4 重组蛋白的表达  25-27
    2.4.5 重组蛋白可溶性分析  27
    2.4.6 重组蛋白亲和层析分离纯化  27-28
    2.4.7 SDS-PAGE分析纯化组分  28
    2.4.8 包涵体的透析复性  28
    2.4.10 蛋白质浓度测定  28
  2.5 结果  28-34
    2.5.1 目的基因的PCR扩增产物  28-29
    2.5.2 重组质粒PCR鉴定  29
    2.5.3 重组质粒酶切鉴定  29-30
    2.5.4 重组基因的测序鉴定结果  30
    2.5.5 重组基因的诱导表达结果  30-34
3 结核分枝杆菌ESAT-6基因的原核表达  34-42
  3.1 实验材料  34
  3.2 主要试剂  34
    3.2.1 主要溶液  34
    3.2.2 主要实验仪器  34
  3.3 实验方法  34-37
    3.3.1 目的基因的制备  34-35
    3.3.2 重组质粒构建  35-36
    3.3.3 重组蛋白诱导表达表达  36
    3.3.4 重组蛋白可溶性分析  36
    3.3.5 重组蛋白纯化  36-37
    3.3.6 重组pET30a-esat-6蛋白质浓度测定  37
  3.4 实验结果  37-42
    3.4.1 PCR电泳结果  37
    3.4.2 目的片段酶切图  37-38
    3.4.3 重组质粒鉴定结果  38-39
    3.4.4 重组基因诱导表达结果  39-41
    3.4.5 重组蛋白pET30a-Rv1984c浓度  41-42
4 ELISA法检测结核分枝杆菌特异性抗原及临床应用  42-50
  4.1 引言  42
  4.2 材料与方法  42-43
    4.2.1 诊断用抗原  42
    4.2.2 主要试剂  42-43
  4.3 实验方法  43-46
    4.3.1 rRv1984c最佳包被浓度确定和血清稀释浓度确定  43-44
    4.3.2 底物反应时间的选择  44
    4.3.3 ELISA法检测rRv1984c抗原的敏感性和特异性  44
    4.3.4 rESAT-6-ELISA检测方法的建立  44
    4.3.5 ESAT-6-CFP-10-16KD混合抗原ELISA检测方法的确立  44-45
    4.3.6 批内和批间抗原稳定性试验  45
    4.3.7 间接ELISA法检测结核分枝杆菌特异性抗原在临床上的应用  45-46
  4.4 结果与分析  46-50
    4.4.1 rRv1984c-ELISA最佳反应条件的确立  46-47
    4.4.2 rRv1984c-ELISA临界值确定  47
    4.4.3 底物反应时间结果的选择  47
    4.4.4 rRv1984c-ELISA在临床上的应用  47-48
    4.4.5 rESAT-6-ELISA和混合抗原最佳反应条件的确立  48
    4.4.6 批内和批间重复性试验  48
    4.4.7 rESAT-6-ELISA和ESAT-6-CFP-10-16KD-ELISA联合抗原在临床上的应用  48-50
5 讨论  50-54
6 结论  54-56
参考文献  56-62
中英文缩略语  62-64
致谢  64-66
发表论文和参加的研究课题  66

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