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具群体感应抑制活性海洋真菌的筛选与群体感应抑制因子的初步研究

作　者: 邹姗姗
导　师: 于文功
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生药学
关键词: 铜绿假单胞菌群体感应抑制因子筛选模型海洋真菌活性追踪分离
分类号: R915
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

铜绿假单胞菌是一种常见的机会致病菌,可在人群中引起严重的急性和慢性感染,对于免疫力低下者或其他重症患者都具有严重的危害性,是病人在住院期间发生感染的第三大致病菌。由于铜绿假单胞菌对许多抗生素都具有内在抗药性,而且形成生物被膜后对抗生素的敏感度也降低,使得治疗铜绿假单胞菌感染十分困难。近期研究发现,铜绿假单胞菌的致病性是受到一种被称为群体感应(Quorum Sensing,QS)的胞间信号传导系统调控的。QS系统是细菌根据菌群密度变化调控个体基因表达的一种重要的全面调控机制。铜绿假单胞菌多种毒力因子的分泌以及生物被膜的形成等都是受其调控的。因此,通过抑制QS系统来控制铜绿假单胞菌致病性有望成为治疗铜绿假单胞菌感染的一个新策略。本文以铜绿假单胞菌las、rhl群体感应系统为靶标,以蔗糖致死基因sacB为报告基因,构建了质粒pZ-1(Plac-lasR,PlasI-sacB)和pZ-2(PrhlR-rhlR,PrhlI-sacB)。将pZ-1和pZ-2分别转入铜绿假单胞菌双缺失菌株PAO-MW1(ΔlasIΔrhlI),建立了两个快速、高效的群体感应抑制因子(QSI)筛选模型QlasI(pZ-1,PAO-MW1)和Qrhll(pZ-2,PAO-MW1),可用于微生物、植物等粗提物以及化合物的活性筛选。从胶州湾海水、海泥中分离海洋真菌,利用构建的筛选模型对真菌发酵提取物进行活性筛选,从中发现3株真菌发酵提取物具有抑制铜绿假单胞菌las群体感应系统的活性。对活性最强的菌株QJ012进行了种属鉴定,其ITS序列与黑绿青霉(Penicillium atramentosum)ITS部分序列有100%的同源性,Biolog系统鉴定结果也表明QJ012与Penicillium atramentosum相似度最高。通过在分离过程中利用QlasI筛选模型进行活性追踪的方法,从QJ012发酵物总浸膏中分离得到一个具有铜绿假单胞菌群体感应抑制活性的化合物,利用质谱(MS)、核磁(1H NMR,13C NMR, DEPT)等方法确定其为聚酮类化合物4,6-二甲基-7-[(1R,2E,4aS,6S,7R,8R,8aR)-1,2,4a,5,6,7,8,8a-八氢-7-羟基-2-(3-羟基-2-氧-亚丙基)-3,6,8-三甲基-1-萘基]-(2E,4E,6E)-庚三烯酸。该化合物能够降低QS相关基因lasB、lasI、lasR、toxA基因的表达,并能降低P. aeruginosa毒力因子弹性蛋白酶和绿脓菌素的产生、抑制生物被膜的形成。综上所述,本文建立了两个快速、高效的铜绿假单胞菌群体感应抑制因子筛选模型；发现3株海洋真菌发酵提取物具有抑制铜绿假单胞菌las群体感应系统的活性；活性最强的菌株QJ012经鉴定为黑绿青霉(Penicillium atramentosum),此前未见Penicillium atramentosum具有铜绿假单胞菌群体感应抑制活性的报道；从QJ012中分离得到一个聚酮类化合物,首次发现该化合物具有抑制铜绿假单胞菌群体感应系统的活性,该物质可能成为抗致病菌药物的先导化合物。以上工作对新型抗菌药物的研究和开发具有重要意义。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-13
0 前言  13-34
  0.1 细菌耐药性与新型抗菌药物研究的必要性  13-14
  0.2 细菌的群体感应系统  14-17
    0.2.1 革兰氏阴性菌中由AHL介导的LuxI-LuxR型群体感应系统  15-16
    0.2.2 革兰氏阳性菌中由寡肽介导的群体感应系统  16-17
    0.2.3 细菌中感知种间信息的群体感应系统  17
  0.3 铜绿假单胞菌感染现状  17-23
    0.3.1 铜绿假单胞菌致病机理  17-20
    0.3.2 铜绿假单胞菌耐药机制  20-23
  0.4 干扰群体感应——控制铜绿假单胞菌感染的新靶点  23-30
    0.4.1 铜绿假单胞菌中的群体感应系统  23-24
    0.4.2 铜绿假单胞菌群体感应抑制剂研究现状  24-30
  0.5 海洋真菌活性次级代谢产物研究概况  30-31
  0.6 铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的筛选  31-32
  0.7 本文的研究内容及意义  32-34
1 铜绿假单胞菌群体感应抑制因子筛选模型的构建  34-52
  1.1 实验材料、仪器及试剂  34-36
  1.2 实验方法  36-46
    1.2.1 构建铜绿假单胞菌las系统群体感应抑制剂筛选模型  36-42
    1.2.2 筛选模型PAO1(pZ-1)和PAO-MW1(pZ-1)平板筛选效果的比较  42
    1.2.3 构建铜绿假单胞菌rhl系统群体感应抑制因子筛选模型  42-45
    1.2.4 筛选模型PAO1(pZ-2)和PAO-MW1(pZ-2)平板筛选效果的比较  45-46
  1.3 实验结果  46-50
    1.3.1 质粒pZ-1的构建及鉴定  46-47
    1.3.2 筛选模型PAO1(pZ-1)和PAO-MW1(pZ-1)平板筛选效果的比较  47-48
    1.3.3 质粒pZ-2的构建及鉴定  48-49
    1.3.4 筛选模型PAO1(pZ-2)和PAO-MW1(pZ-2)平板筛选效果的比较  49-50
  1.4 讨论  50-51
  1.5 小结  51-52
2 具群体感应抑制活性海洋真菌的分离筛选、种属鉴定及发酵生产  52-65
  2.1 实验材料、仪器及试剂  52-53
  2.2 实验方法  53-58
    2.2.1 具群体感应抑制活性海洋真菌的筛选  53-54
      2.2.1.1 海洋真菌的分离与培养  53-54
      2.2.1.2 海洋真菌的发酵培养和提取物的制备  54
      2.2.1.3 真菌提取物的活性筛选  54
      2.2.1.4 活性真菌QJ012提取物对野生型铜绿假单胞菌PAO1生长的影响  54
    2.2.2 利用ITS序列分析法和Biolog微生物鉴定系统对真菌QJ012进行种属鉴定  54-57
      2.2.2.1 ITS序列分析法  54-56
      2.2.2.2 Biolog微生物鉴定系统  56-57
    2.2.3 活性真菌QJ012的发酵生产  57-58
      2.2.3.1 发酵培养基选择试验  57
      2.2.3.2 溶剂萃取试验  57
      2.2.3.3 生产发酵  57-58
      2.2.3.4 发酵提取物的制备  58
      2.2.3.5 发酵提取物的活性测定及成分分析  58
  2.3 实验结果  58-63
    2.3.1 具有群体感应抑制活性海洋真菌的筛选  58-60
      2.3.1.1 海洋真菌的分离  58-59
      2.3.1.2 真菌提取物的活性筛选  59
      2.3.1.3 活性真菌QJ012提取物对野生型铜绿假单胞菌PAO1生长的影响  59-60
    2.3.2 利用ITS序列分析法和Biolog微生物鉴定系统对真菌QJ012进行种属鉴定  60-62
      2.3.2.1 菌株QJ012的ITS序列测定  60-61
      2.3.2.2 活性真菌QJ012系统发育学分析  61-62
      2.3.2.3 Biolog微生物鉴定系统鉴定结果  62
    2.3.3 活性真菌QJ012发酵生产研究  62-63
      2.3.3.1 培养基选择试验  62-63
      2.3.3.2 溶剂萃取实验结果  63
      2.3.3.3 发酵提取物的活性测定及成分分析  63
  2.4 讨论  63-64
  2.5 小结  64-65
3 QJ012发酵物中群体感应抑制因子的分离、鉴定与活性评价  65-85
  3.1 实验材料、仪器及试剂  65-67
  3.2 实验方法  67-73
    3.2.1 真菌QJ012发酵物中群体感应抑制因子的分离纯化  67-69
      3.2.1.1 发酵物总浸膏溶解性实验  67
      3.2.1.2 TLC分离条件摸索  67
      3.2.1.3 发酵物总浸膏成分的活性追踪分离  67-69
    3.2.2 化合物的结构鉴定  69-70
      3.2.2.1 质谱(MS)分析  69
      3.2.2.2 核磁共振(NMR)分析  69
      3.2.2.3 比旋度测定  69-70
    3.2.3 群体感应抑制因子的活性评价  70-73
      3.2.3.1 不同浓度的式(Ⅰ)化合物的群体感应抑制活性  70
      3.2.3.2 不同浓度的式(Ⅰ)化合物对野生型铜绿假单胞菌PAO1生长的影响  70
      3.2.3.3 式(Ⅰ)化合物在转录水平对PAO1受QS调控的相关毒力基因的影响  70-72
      3.2.3.4 式(Ⅰ)化合物对PAO1弹性蛋白酶产量的影响  72
      3.2.3.5 式(Ⅰ)化合物对PAO1绿脓菌素产量的影响  72-73
      3.2.3.6 式(Ⅰ)化合物对PAO1生物被膜形成能力的影响  73
  3.3 实验结果  73-84
    3.3.1 真菌QJ012发酵物中群体感应抑制因子的分离纯化  73-76
      3.3.1.1 发酵物总浸膏溶解性实验  73
      3.3.1.2 TLC分离条件摸索  73-74
      3.3.1.3 发酵物总浸膏成分的活性追踪分离  74-76
    3.3.2 化合物的结构鉴定  76-80
    3.3.3 群体感应抑制因子的活性评价  80-84
      3.3.3.1 不同浓度的式(Ⅰ)化合物的群体感应抑制活性  80
      3.3.3.2 不同浓度的式(Ⅰ)化合物对野生型铜绿假单胞菌PAO1生长的影响  80-81
      3.3.3.3 式(Ⅰ)化合物在转录水平对PAO1受QS调控的相关毒力基因的影响  81-82
      3.3.3.4 式(Ⅰ)化合物对PAO1弹性蛋白酶产量的影响  82-83
      3.3.3.5 式(Ⅰ)化合物对PAO1绿脓菌素产量的影响  83
      3.3.3.6 式(Ⅰ)化合物对PAO1生物被膜形成能力的影响  83-84
  3.4 讨论  84
  3.5 小结  84-85
4 总结与展望  85-86
参考文献  86-92
致谢  92-93
个人简介  93
在学期间发表的学术论文与研究成果  93

具群体感应抑制活性海洋真菌的筛选与群体感应抑制因子的初步研究

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