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γ-干扰素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

作　者: 冯春燕
导　师: 于文功
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生药学
关键词: 铜绿假单胞菌生物膜 γ-干扰素细菌群体感应
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

生物膜(Biofilm)是细菌和其分泌的胞外基质在物体表面形成的高度组织化的多细胞结构,它是细菌生长过程中为适应生存环境而形成的一种与浮游细胞相对应的存在形式。一旦形成生物膜,细菌将具有极强的抗生素耐药性(比浮游细菌高100-1000倍)和逃避机体免疫系统攻击的能力。根据美国NIH的调查公告,80%以上的细菌性感染与生物膜有关。因此,如何防治细菌生物膜已成为人类面临的巨大挑战。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见条件致病菌,可引起多种感染,其中呼吸道感染最为常见,近来铜绿假单胞菌的发病率呈明显上升趋势,且耐药性日趋严重。铜绿假单胞菌具有极强的环境适应能力和生物膜形成能力。宿主与病原菌的相互作用是医学和微生物学领域研究的前沿和热点,目前绝大多数研究集中在宿主如何感知病原菌的侵入和调节免疫系统清除病原菌方面。然而,关于病原体如何感知宿主免疫系统并相应改变自身表型逃脱免疫系统攻击的研究却很少。最近有人报道,铜绿假单胞菌能够利用其外膜蛋白OprF感知宿主细胞产生的免疫因子γ-干扰素,从而激活自身的群体感应系统来促进毒性因子的表达。本论文旨在研究铜绿假单胞菌是否能感知γ-干扰素促进其生物膜的形成,从而产生免疫逃逸。本文建立了静态和动态铜绿假单胞菌生物膜模型,研究了γ-干扰素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响。结果表明,γ-干扰素能够显著地促进铜绿假单胞菌生物膜的形成。随着γ-干扰素浓度、作用时间和菌体密度的不同,对铜绿假单胞菌生物膜形成的作用也不同。在静态生物膜模型中,当γ-干扰素浓度为10ng/mL、处理6h和菌液OD600为1.8时,γ-干扰素对铜绿假单胞菌生物膜形成的促进作用最强,达到40%;在动态生物膜模型中,γ-干扰素浓度为10ng/mL和作用时间为72h时,效果最明显,生物膜的生物量和平均厚度分别增加了3倍和2倍。为了排除细菌生长代谢因素对生物膜形成的影响,我们检测了γ-干扰素对铜绿假单胞菌浮游菌生长的影响。结果证明,铜绿假单胞菌的生长代谢不受γ-干扰素的影响。研究已发现,生物膜的形成和成熟与细菌群体感应系统有关。群体感应是细菌根据细胞密度变化进行基因表达调控的一种群体行为。为了探讨γ-干扰素促进铜绿假单胞菌生物膜形成的机制,利用群体感应系统rhlI突变菌株PDO100、lasI突变菌株PAO-JP1和rhlI / lasI双突变菌株PAO-MW,分别检测了γ-干扰素对其生物膜形成的影响。结果证明,γ-干扰素主要通过rhl群体感应系统促进铜绿假单胞菌生物膜形成。同时,γ-干扰素对铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF缺失菌株的生物膜形成没有影响,表明OprF是γ-干扰素的受体。综上所述,在病原菌与宿主之间的相互作用中,铜绿假单胞菌能够利用外膜蛋白OprF感知宿主细胞产生的γ-干扰素,激活自身的rhl群体感应系统,促进生物膜的形成,从而抵御宿主免疫系统的攻击,形成一种自身保护机制。本文从病原体的角度,阐明了病原菌如何根据宿主免疫系统的变化来调节自身的生存方式和产生免疫逃逸,为深入了解病原菌的致病机理和有效地防治细菌生物膜感染创造了条件。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
一、文献综述  12-32
  1. 铜绿假单胞菌及其危害  12-13
  2. 生物膜  13-22
    2.1 生物膜概念及结构  13-14
    2.2 生物膜的形成过程  14-17
    2.3 生物膜相关感染的机制  17-19
    2.4 生物膜相关感染的防治  19-22
  3. 群体感应现象的提出和研究现状  22-26
  4. 群体感应与生物膜的关系  26-27
  5. 病原菌与宿主之间的关系  27-28
  6. γ-干扰素  28-30
    6.1 γ-干扰素的产生  28
    6.2 γ-干扰素的分子结构和基因  28-29
    6.3 γ-干扰素受体  29
    6.4 γ-干扰素的生物学活性  29-30
    6.5 γ-干扰素的临床应用  30
  7. 小结  30-32
二、PAO1 生物膜动态、静态模型的建立  32-46
  1. 材料与方法  32-36
    1.1 材料  32-33
      1.1.1 菌株与质粒  32
      1.1.2 仪器和试剂  32-33
    1.2 铜绿假单胞菌PAO1 微管生物膜模型的构建  33
    1.3 96 孔板生物膜模型的构建  33
    1.4 PAO1 电转化条件的优化  33-35
      1.4.1 质粒pMRP9-1 的提取（QIAGEN试剂盒）  33-34
      1.4.2 P. aeruginosa PAO1 电转化感受态细胞的制备  34
      1.4.3 电转化  34-35
      1.4.4 质粒转化子的筛选、鉴定及转化效率的计算  35
    1.5 Flow cell实验  35-36
  2. 结果  36-43
    2.1 PAO1 微管生物膜模型的构建  36
    2.2 96 孔板生物膜模型的构建  36-37
    2.3 PAO1 质粒电转化的最佳条件  37-41
      2.3.1 细菌生长状态对质粒电转化效率的影响  37-38
      2.3.2 电击电压对转化效率的影响  38-39
      2.3.3 细胞浓度对质粒转化效率的影响  39
      2.3.4 感受态细胞的储备方式对转化效率的影响  39-40
      2.3.5 质粒转化子的鉴定  40-41
    2.4 Flow cell模型的构建  41-43
  3. 讨论  43-44
  4. 小结  44-46
三、γ-干扰素对PAO1 生物膜形成的影响  46-55
  1. 材料与方法  46-47
    1.1 材料  46
      1.1.1 菌株  46
      1.1.2 试剂  46
    1.2 不同浓度γ-干扰素对PAO1 生物膜形成的影响  46
    1.3 γ-干扰素对PAO1 浮游菌生长的影响  46-47
    1.4 γ-干扰素对不同OD值的PAO1 生物膜形成的影响  47
    1.5 Flow cell实验  47
  2. 结果  47-53
    2.1 γ-干扰素促进PAO1 生物膜的形成  47-49
    2.2 γ-干扰素不影响PAO1 浮游菌的生长  49-50
    2.3 γ-干扰素对不同OD值的PAO1 生物膜形成的影响  50-51
    2.4 Flow cell实验  51-53
  3. 讨论  53-54
  4. 小结  54-55
四、γ-干扰素促进PAO1 形成生物膜的机制探讨  55-63
  1. 材料与方法  55-56
    1.1 材料  55
      1.1.1 菌株  55
      1.1.2 试剂  55
    1.2 静态造膜检测γ-干扰素对PAO1 突变菌株生物膜形成的影响  55
    1.3 Flow cell实验  55-56
  2. 结果  56-61
    2.1 γ-干扰素对PAO1 突变菌株生物膜形成的影响  56-57
    2.2 Flow cell实验  57-61
  3. 讨论  61-62
  4. 小结  62-63
总结与展望  63-65
参考文献  65-78
致谢  78-79
发表文章情况  79

γ-干扰素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

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