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炭疽芽孢杆菌和霍乱弧菌实时定量PCR快速检测体系的建立及评价

作　者: 吴丽娟
导　师: 蔡剑平
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 炭疽芽孢杆菌序列分析 DNA探针实时聚合酶链反应细菌基因组实时定量PCR 模拟标本霍乱霍乱弧菌霍乱毒素实时聚合酶链式反应
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

背景:炭疽是一种多见于在动物间传播的传染性疾病,其传染源为炭疽芽孢杆菌的芽孢。炭疽这个名称来源于希腊语中的煤炭(anthrakis),因为特异性的黑痂为该疾病的主要特征。17世纪的欧洲曾发生过一次炭疽大流行,导致约6万人丧生。1954年,炭疽毒素(toxin)在炭疽致病中的作用被阐明。2001年,炭疽首次被真正作为生化武器用于恐怖袭击。炭疽可分为三种临床型:皮肤炭疽、肠炭疽、肺炭疽,其中皮肤炭疽可以通过特异性的临床表现(炭样黑色痂皮)和细胞培养进行确诊;而肠炭疽和肺炭疽则因易与其他肠道和肺部疾病混淆而不易诊断,因此,实验室诊断方法成为了有效的辅助诊断方法,如聚合酶链反应(PCR)、血清学检查(PA-basedELISA)以及相关组织的免疫组化检测等。随着检测技术的不断发展,越来越多的检测方法被用于各种细菌的检测中,其中实时定量PCR技术以其快速、通用、高效、全封闭反应等优点越来越受到科研及临床工作者的欢迎,特别是在防止恐怖袭击方面,能够高效快速的检测出炭疽杆菌,对防止生化武器污染极为重要。本研究,我们建立了快速鉴别炭疽芽孢杆菌的单重和多重实时定量PCR体系,并用相关菌种进行了该检测体系的特异性评价,以及用临床模拟粪便标本对该体系开展了临床应用价值的评价。目的:以炭疽芽孢杆菌的主基因组特异性序列GS和毒素质粒(pXO1)上的致病毒素基因pagA特异性序列为检测靶点,建立高敏感、高特异的荧光单重和双重实时TaqMan聚合酶链反应快速检测体系,并将该体系应用于临床模拟标本的检测,以验证其开展实际临床应用的价值。方法:根据炭疽杆菌主基因组特异性序列(Gs)和特异的毒力岛pagA基因序列(pagA)设计相应的引物和探针,构建含目的基因序列的质粒作为标准模板,利用TaqMan标记探针和Cepheid公司的便携式Smart CyclerⅡ进行实时聚合酶链反应,建立炭疽芽孢杆菌基因快速检测体系,评价该检测体系的检测敏感性和特异性,同时用从炭疽灭活疫苗和临床模拟标本中提取的基因组DNA对该体系进行了临床应用价值的评价。结果:该实时定量PCR检测体系中单基因检测位点检测体系(单重检测体系)在检测炭疽芽孢杆菌质粒标准品时的检测敏感度达10~1copies/reaction,检测炭疽芽孢杆菌灭活疫苗基因组DNA标本时的检测敏感度达100fg/reaction,检测粪便模拟标本时的检测敏感度达10~2CFU/reaction;双基因检测位点检测体系(双重检测体系)在检测质粒标准品时的检测敏感度达10~2copies/reaction,检测疫苗基因组DNA标本时的检测敏感度达1pg/reaction,检测粪便模拟标本时的检测敏感度达10~2CFU/reaction。该检测体系不论单重还是双重检测体系均达到较高水平的敏感度,该检测体系在检测其他蜡样杆菌群细菌时未出现非特异性扩增,具有较高的特异性。整个实时聚合酶链反应在1h内完成,适合于实验室或野外环境下炭疽芽孢杆菌的快速检测。结论:本研究建立的单重及双重TaqMan实时聚合酶链反应检测体系可作为炭疽芽孢杆菌快速、准确、特异、敏感的检测手段。有望在临床检验、食品卫生、疾病控制和出入境检疫等领域发挥重要作用。背景:霍乱(cholera)是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的一种烈性肠道传染病,它主要通过污染的水源和食物等进行传播。自1817年至今霍乱已发生7次全球性大流行,据世界卫生组织(WHO)报告,霍乱每年发生病例10万例,给人们生命健康及社会经济发展带来极大威胁。传统的采用以分离培养为基础的检测方法工作量大、耗时长,对于一些含菌量低的标本,或处于VBNC状态的霍乱弧菌检出率低甚至不能检出。而以核酸检测为基础的基因诊断方法,则因为其对标本要求低,反应灵敏快速,已逐渐成为霍乱诊断研究领域的研究重点。方法:以霍乱弧菌毒素编码基因ctxA和O抗原编码基因rfb作为靶基因,将ctxA基因序列、O1群霍乱弧菌rfb基因簇序列和O139群霍乱弧菌,rfb基因簇序列用Blast工具在GeneBank中比对,寻找出特异保守的rfb序列-O1群(O1 rfb region)、rfb序列-O139群(O139 rfb region)、ctxA序列,作为检测的靶序列。针对检测靶序列设计引物和探针,并构建rfb-O1(O1 ryo region)、rfb-O139(O139 ryo region)和ctxA的克隆。对提取的质粒进行紫外定量,再倍比稀释,制成标准品。用标准品优化反应条件,建立单基因位点(单重)、双基因位点(双重)及三基因位点(三重)TaqManreal-time PCR检测体系。将霍乱疫苗定量倍比稀释后,掺入至健康人的粪便标本中,制成模拟的霍乱患者临床标本,用模拟标本对该体系进行了临床应用价值的评价。以23种其他肠道菌作为阴性对照菌,以质粒标准品和霍乱疫苗基因组DNA标本作为阳性样品,用以评价所建检测体系的灵敏度、特异性和稳定性、实用性。结果:该检测体系中单基因位点检测体系(单重检测体系)在检测霍乱弧菌三种质粒标准品时的检测敏感度达10~1copies/reaction,检测O1和O139群霍乱弧菌灭活疫苗提取基因组DNA标本时的检测敏感度分别达100fg/reaction和1pg/reaction,检测O1和O139群霍乱弧菌粪便模拟标本时的检测敏感度分别达10~2CFU/reaction和10~3CFU/reaction;O1群霍乱弧菌双基因位点检测体系(双重检测体系)在检测质粒标准品时敏感度达10~2copies/reaction,检测疫苗提取基因组DNA标本时敏感度达100fg/reaction,检测粪便模拟标本时敏感度达10~3CFU/reaction;O139群霍乱弧菌双基因位点检测体系(双重检测体系)在检测质粒标准品时敏感度达10~2opies/reaction,检测疫苗提取基因组DNA标本时敏感度达1pg/reaction,检测粪便模拟标本时敏感度达10~3CFU/reaction;O1、O139群同时检测的三基因位点检测体系(三重检测体系)在检测三种质粒标准品时敏感度达10~2copies/reaction,检测疫苗提取基因组DNA标本时对O1群和O139群疫苗的检出率分别为100fg/reaction和1pg/reaction,检测粪便模拟标本时对分别混入O1群和O139群疫苗的标本检出率均达10~3CFU/reaction。该检测体系不论单重、双重还是三重检测体系均达到较高水平的灵敏度。对23种其他肠道菌进行多次重复试验,均没有扩增曲线出现,说明该检测体系具有较好的特异性,且整个反应可在1小时内全部完成。结论:本研究采用TaqMan探针技术建立了霍乱弧菌三重实时PCR检测体系,检测灵敏度高,特异性好,速度快,一次反应可实现对霍乱弧菌定性、定量、分型以及毒性检测的目的,有望在临床检验、食品卫生、疾病控制和出入境检验等领域发挥重要的作用

全文目录

第一部分炭疽杆菌实时定量PCR快速检测体系的建立及评价  5-46
  中文摘要  6-8
  英文摘要  8-10
  前言  10-13
  材料与方法  13-27
  结果  27-42
  讨论  42-44
  结论  44-45
  参考文献  45-46
第二部分霍乱弧菌实时定量PCR快速检测体系的建立及评价  46-104
  中文摘要  47-49
  英文摘要  49-51
  前言  51-53
  材料与方法  53-66
  结果  66-97
  讨论  97-100
  结论  100-102
  参考文献  102-104
第三部分附录  104-124
  中英文缩略词表  105-107
  文献综述一  107-116
  文献综述二  116-124
  致谢  124

炭疽芽孢杆菌和霍乱弧菌实时定量PCR快速检测体系的建立及评价

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