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铜绿假单胞菌中影响吩嗪合成基因操纵子phzA1的调节基因的研究

作　者: 李苓苓
导　师: 段康民
学　校: 西北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 铜绿假单胞菌吩嗪群体感应系统基因敲除转座突变
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一个分布广泛的机会致病菌[1],在烧伤病人、器官移植病人、免疫力低下病人,如接受化学治疗的癌症病人和艾滋病病人中,它几乎可以感染人体的任何组织并常常危及患者生命。它对许多抗生素具备很高的内在抗药性,并可产生许多致病因子,如碱性蛋白酶(alkalineprotease)和吩嗪(phenazine)等,是难以治疗的病原菌。绿脓菌素作为吩嗪的一种衍生物,不仅是一种致病因子,更重要的是作为铜绿假单胞菌中的一种信号分子。因此,研究吩嗪合成的调节途径对于了解铜绿假单胞菌的致病机制和微生物群体中不同细菌间的相互作用具有重要意义。本文运用转座子突变方法,对含有报道质粒miniCTX-phzAl的铜绿假单胞菌进行转座子随机突变,筛选影响吩嗪合成的调节突变体。筛选到了6个影响吩嗪合成的突变体,并对这6个突变体进行了鉴定,确定突变体中转座子插入位点,从而确定转座子所破坏的基因。并根据生物信息分析结果,推测其功能。研究结果为了解铜绿假单胞菌致病因子的调节机理提供了新的数据和线索。同时,对一个菌落和颜色发生明显变化的突变体进行的深入研究表明,该转座突变的基因是铜绿假单胞菌的一个新转录调节基因。并通过基因敲除的方法验证了该基因的功能。采用基因敲除的方法,构建了负责ABC转运系统的两个基因PA0602和PA4594基因的突变体。研究这两个基因是否参与低抑制浓度四环素对吩嗪合成基因phzAl的调节。探索了这两个基因与群体感应体调节系统和PQS系统之间一定的关系。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-6
缩写对比表  6-9
图目录  9-10
表目录  10-11
第一章绪论  11-27
  1.1 铜绿假单胞菌抗药性的研究概况  11-12
    1.1.1 铜绿假单胞菌的致病因子  11-12
  1.2 铜绿假单胞菌的耐药机制  12-15
    1.2.1 外膜的低渗透  12
    1.2.2 主动泵出系统  12-13
    1.2.3 β-内酰胺酶  13
    1.2.4 靶位的改变  13
    1.2.5 细菌生物被膜(biofilm)的形成  13-14
    1.2.6 ABC转运体介导的耐药性  14-15
  1.3 群体感应系统研究概况  15-20
    1.3.1 革兰氏阳性菌的群体感应系统  15-16
    1.3.2 革兰氏阴性菌的群体感应系统  16-18
      1.3.2.1 自诱导物AHLs分子  16-17
      1.3.2.2 铜绿假单胞菌的群体感应系统调节机制  17-18
    1.3.3 群体感应系统的作用  18-20
      1.3.3.1 群体感应系统与外排泵的关系  18-19
      1.3.3.2 QS对β-内酰胺酶的调节  19
      1.3.3.3 QS影响生物被膜的形成  19
      1.3.3.4 QS系统控制许多致病因子的表达  19-20
      1.3.3.5 QS系统控制鞭毛合成基因的表达  20
  1.4 吩嗪类化合物的研究概况  20-22
    1.4.1 吩嗪类化合物的基本特性  20-21
    1.4.2 吩嗪类化合物的调节机制  21-22
  1.5 抗生素的研究概况  22-26
    1.5.1 抗生素的研究现状  22-23
    1.5.2 抗生素的作用  23-25
      1.5.2.1 抗生素影响致病菌的致病性  24
      1.5.2.2 影响细菌的压力反应或由转录调节子负责的诱导反应  24-25
      1.5.2.3 抗生素调节并影响致病因子的表达  25
      1.5.2.4 低于抑制浓度抗生素与药物外排泵的关系  25
    1.5.3 研究低于抑制浓度抗生素的意义  25-26
  1.6 本课题研究内容和目的  26-27
第二章试验材料和方法  27-44
  2.1 试验材料  27-30
    2.1.1 菌株，引物和质粒  27-28
    2.1.2 培养基的配置  28-29
    2.1.3 试剂  29-30
    2.1.4 仪器  30
  2.2 试验方法  30-44
    2.2.1 质粒的小量提取  30-31
    2.2.2 细菌基因组DNA的提取  31
    2.2.3 感受态细胞的制备  31-32
    2.2.4 电转化  32
    2.2.5 启动子——报道子载体的构建  32-33
    2.2.6 四环素Tc对铜绿假单胞菌PAO的最小抑制浓度MIC的测定  33-34
    2.2.7 测低于MIC的四环素Tc对PAO基因的表达情况  34
    2.2.8 双亲株杂交试验  34
    2.2.9 三亲株杂交试验  34-35
    2.2.10 phzA1调节基因的筛选试验  35-41
      2.2.10.1 转座突变  35-37
      2.2.10.2 突变体的筛选  37-38
      2.2.10.3 随机PCR(Arbitrary PCR)  38-40
      2.2.10.4 突变体的验证  40
      2.2.10.5 转座子插入位点的确定即调节基因的确定  40-41
    2.2.11 PA1196的基因敲除试验  41
    2.2.12 互补实验  41-42
    2.2.13 基因表达水平的测定  42-43
    2.2.14 绿脓菌素的测定  43
    2.2.15 丛集运动试验(Twitching mobility)  43
    2.2.16 泳动试验(Swimming mobility)  43
    2.2.17 PA1196对抗生素的敏感性试验  43-44
第三章实验结果  44-57
  3.1 PA1196基因的研究  44-50
  3.2 影响吩嗪合成基因的筛选  50-54
    3.2.1 筛选得到六个未知基因的突变体  50-52
    3.2.2 突变体产量绿脓菌素的测定  52-53
    3.2.3 突变体突变基因的确定  53
    3.2.4 转座子插入位点的核苷酸序列分析  53-54
    3.2.5 转座突变体功能分析  54
  3.3 PA4594和PA0602基因的研究  54-57
    3.3.1 PA0602基因受QS系统的调节  54-55
    3.3.2 PA0602和PA4594受低于最小抑制浓度四环素的调节  55-57
第四章讨论  57-63
  4.1 PA1196新转录调节基因的研究  57-59
  4.2 影响吩嗪合成基因的筛选及其鉴定  59-62
  4.3 RA4594，PA0602基因的研究  62-63
第五章全文小结  63-64
参考文献  64-70

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