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烟草柱头分泌物蛋白组学分析及囊泡运输相关基因功能鉴定

作　者: 徐猛
导　师: 王芳；张宪省
学　校: 山东农业大学
专　业: 发育生物学
关键词: 囊泡运输蛋白质组学 VIGS 烟草柱头分泌物
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

被子植物有性生殖的顺利完成依赖于花粉与雌蕊各组织间一系列的相互作用,其中花粉与柱头之间的互作是其中一个关键步骤。在授粉过程中,柱头识别附着的花粉,为亲和的花粉提供进行授粉所需的营养成分,而抑制不亲和的花粉水合、萌发和花粉管的伸长。研究柱头在花粉-柱头识别过程中的作用对于人们理解植物授粉识别的分子机理进而通过分子遗传学的手段提高农作物的产量具有重要的意义。湿柱头植物柱头分泌物中的一些蛋白质可能参与花粉-柱头识别过程,或辅助花粉管生长并伸入柱头组织。本研究利用蛋白质组学的方法对湿柱头植物烟草的柱头分泌物蛋白进行分析和鉴定,并利用VIGS技术鉴定到两个囊泡运输相关蛋白的生物学功能。研究结果如下:运用双向电泳和生物质谱的方法鉴定出132种烟草柱头分泌物蛋白质,并对这些蛋白质的功能和性质进行了分析和总结,发现参与抗性和胁迫响应、细胞壁合成修饰、蛋白质代谢、信号转导、囊泡运输等过程的蛋白质在烟草柱头分泌物洗脱蛋白中占到很大的比例。Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)分析发现,多数基因在烟草柱头中特异或优势表达,其转录水平与蛋白水平基本相一致,说明烟草柱头分泌物洗脱蛋白组学分析具有较高的可靠性。本研究鉴定到的NtRab8-6可能是烟草小G蛋白Rab8家族一个新的成员。降低NtRab8-6的表达导致植株严重矮化,叶形态异常,叶片小且卷曲,叶下表皮细胞减小,叶柄与主茎夹角增大,根系不发达。同时,花变小,雄蕊败育,雌蕊花柱变短且柱头形态异常,不能完成授粉识别过程。进一步研究发现,NtRab8-6的表达受乙烯负调控,NtRab8-6参与乙烯信号转导途径,柱头因发育异常而影响授粉识别过程。此外,烟草NtSEC8参与调控花粉的萌发和花粉管伸长,沉默植株因花粉萌发和花粉管生长障碍而影响结实,造成育性下降。综上所述,本研究结果表明烟草柱头分泌物表达蛋白可能参与授粉过程。其中囊泡运输相关蛋白NtRab8-6和NtSEC8在烟草的生殖过程中可能起重要作用。

全文目录

中文摘要  8-9
英文摘要  9-11
1 前言  11-27
  1.1 植物柱头和花粉的结构与功能  11-13
    1.1.1 花粉的结构与功能  11
    1.1.2 柱头的结构与功能  11-13
  1.2 被子植物花粉与柱头的相互识别作用  13-19
    1.2.1 干柱头植物花粉与柱头之间的相互识别  14-17
    1.2.2 湿柱头植物花粉与柱头之间的相互识别  17-19
  1.3 花粉-柱头识别过程中的胞吞、胞吐作用  19-20
  1.4 花粉、柱头蛋白质组学研究进展  20-21
  1.5 植株中的小G 蛋白  21-23
  1.6 利用VIGS 技术进行基因功能验证的研究进展  23-25
  1.7 本研究的目的和意义  25-27
2 实验材料与方法  27-39
  2.1 实验材料  27-28
    2.1.1 植物材料及取材条件  27
    2.1.2 菌种和质粒  27
    2.1.3 酶和生化试剂  27
    2.1.4 PCR 引物  27-28
  2.2 实验方法  28-39
    2.2.1 植物材料总蛋白的提取和纯化  28-29
    2.2.2 蛋白质的分离  29-30
    2.2.3 双向电泳凝胶图像分析  30
    2.2.4 蛋白质凝胶斑点切取  30
    2.2.5 蛋白质胶内酶解  30-31
    2.2.6 蛋白质样品脱盐  31
    2.2.7 蛋白质质谱分析  31-32
    2.2.8 MALDI-TOF MS 数据分析  32
    2.2.9 表达载体的构建  32-35
    2.2.10 烟草叶片注射  35-36
    2.2.11 花粉管的苯胺蓝染色分析  36
    2.2.12 花药的亚历山大染色  36
    2.2.13 花粉体外萌发试验  36
    2.2.14 烟草外施乙烯试验  36
    2.2.15 乙烯释放量测定  36-37
    2.2.16 ACC 含量测定  37
    2.2.17 烟草表型恢复实验  37
    2.2.18 qRT-PCR  37-39
3 结果与分析  39-55
  3.1 烟草柱头分泌物及表层细胞蛋白质  39-41
  3.2 蛋白相应基因转录水平检测  41-42
  3.3 利用VIGS 技术验证目的基因功能  42-45
    3.3.1 VIGS 沉默效果验证  42-44
    3.3.2 病毒沉默载体的构建  44-45
  3.4 蛋白P103 功能分析  45-53
    3.4.1 TRV-P103 植株表型观察  45-49
    3.4.2 P103 蛋白序列分析  49-50
    3.4.3 基因NtRab8-6 表达模式分析  50
    3.4.4 NtRab8-6 参与乙烯信号转导过程  50-53
  3.5 蛋白P18.1 功能分析  53-55
    3.5.1 TRV-P18.1 表型观察  53-54
    3.5.2 TRV-P18.1 雄配子体授粉障碍  54-55
4 讨论  55-60
  4.1 烟草柱头分泌物表达蛋白的性质  55-56
  4.2 囊泡运输可能在烟草花粉-柱头识别过程中发挥重要作用  56
  4.3 Rab8 参与调控植株发育  56-57
  4.4 Rab8 参与乙烯信号转导途径  57-58
  4.5 Exocyst 控制花粉萌发和花粉管生长  58-60
5 结论  60-61
参考文献  61-69
附录  69-74
致谢  74

烟草柱头分泌物蛋白组学分析及囊泡运输相关基因功能鉴定

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