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中国部分地区猪血清对甲型H1N1流感病毒的交叉免疫研究分析

作　者: 高蕾
导　师: 刘思当
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 交叉免疫甲型H1N1流感病毒 H1N1亚型猪流感病毒目前流行株 ELISA
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

甲型H1N1流感病毒是一种新发生的全新“三重排”流感病毒,它在人群中的感染导致了全球范围内的传播并造成了21世纪首次全球范围内的流感大流行。2009年5月至11月本次流感爆发后,全球数十个国家和地区陆续报道在猪体内分离到甲型H1N1流感病毒,而在此次流感爆发之前,从未在猪体内分离到该病毒。最近的研究证实甲型H1N1流感病毒可以感染猪并造成“猪-猪”的传播。而猪作为流感病毒的中间宿主,在流感病毒的变异过程中充当了“混合器”的作用。而且目前在中国大陆地区还未有从猪体内分离到甲型H1N1流感病毒的报道,也未知中国地区猪群对甲型H1N1流感病毒的免疫水平。因此很有必要进行中国地区猪血清对该病毒的交叉免疫水平方面的调查和研究。为了调查中国地区猪血清对甲型H1N1流感病毒是否存在交叉免疫,我们分别建立了针对甲型H1N1流感病毒和H1N1亚型猪流感病毒目前流行株的抗体检测方法。首先我们通过PCR分别扩增了A/California/04/2009H1N1(甲型H1N1流感病毒)和A/Swine/Shandong/1123/2008(H1N1)(H1N1亚型猪流感病毒目前流行株)的HA1基因,并克隆到表达载体pET-30a(+)上。建立两个pET - HA1重组质粒(甲型H1N1流感病毒和H1N1亚型猪流感病毒目前流行株),转化宿主菌BL21 (DE3),经IPTG诱导,表达重组蛋白。通过镍柱亲和层析获得纯化的重组蛋白。然后,以重组蛋白作为检测抗原,分别建立了检测甲型H1N1流感病毒抗体和H1N1亚型猪流感病毒目前流行株抗体的间接ELISA方法,并用该方法检测了搜集到的785份猪血清和143份甲流患者血清。随后我们用统计学软件SPSS对两种ELISA检测结果作了相关性分析,表明H1N1亚型猪流感病毒HA1 - ELISA抗体检测结果与甲型H1N1流感病毒HA1 - ELISA抗体检测结果呈显著的线性正相关。这种关系说明猪流感病毒H1N1亚型抗体阳性的猪血清存在对甲型H1N1流感病毒的交叉免疫反应,而甲流患者血清中也存在对猪流感病毒H1N1亚型的交叉免疫反应,显示中国部分地区猪血清对甲型H1N1流感病毒存在交叉免疫。结合序列比对的结果,我们分析产生这种交叉免疫的原因可能是甲型H1N1流感病毒与H1N1亚型猪流感病毒目前流行株之间存在交叉免疫表位。本研究通过对中国部分地区猪血清对甲型H1N1流感病毒的交叉免疫情况进行了血清学调查分析,研究结果丰富了我国甲型H1N1流感病毒流行病学调查内容,同时提示我们要加强对猪流感的防控和检测。

全文目录

中文摘要  9-10
ABSTRACT  10-12
1. 引言  12-29
  1.1 流感病毒综述  12-17
    1.1.1 病毒的结构  12-16
    1.1.2 病毒基因的转录、复制与表达  16
    1.1.3 流感病毒的遗传变异  16-17
    1.1.4 流感病毒的受体结合特异性及其宿主特异型  17
  1.2 甲型H1N1 流感病毒综述  17-19
  1.3 猪流感综述  19-21
  1.4 猪流感的公共卫生学意义  21
  1.5 猪流感与人间流感的大流行  21-23
  1.6 猪流感诊断方法综述  23-28
    1.6.1 传统诊断技术  23-25
    1.6.2 分子生物学诊断技术  25-28
  1.7 研究的目的和意义  28-29
2 材料与方法  29-35
  2.1 材料  29
    2.1.1 菌株和质粒  29
    2.1.2 病毒和血清  29
    2.1.3 主要试剂  29
  2.2 方法  29-33
    2.2.1 原核表达载体pET30a-HA1 的构建  29-31
    2.2.2 重组蛋白的表达、纯化以及wester-blot 检测  31-32
    2.2.3 BCA 法对重组pET30a-HA1-human 和pET30a-HA1-swine 蛋白进行定量  32
    2.2.4 重组蛋白的western-blot 检测  32-33
  2.3 间接ELISA 方法的建立  33-34
    2.3.1 基本步骤  33
    2.3.2 反应条件的优化  33
    2.3.3 特异性试验  33
    2.3.4 重复性试验  33
    2.3.5 临界值的确定  33-34
  2.4 临床样本的检测及猪流感阳性血清的筛选  34
  2.5 检测结果的相关性分析  34
    2.5.1 猪血清检测结果的相关性分析  34
    2.5.2 人血清检测结果的相关性分析  34
  2.6 氨基酸序列比对  34-35
3 结果与分析  35-46
  3.1 原核表达载体PET30A-HA1 的构建  35-36
  3.2 重组蛋白的表达、复性和纯化以及WESTERN-BLOT 检测  36-37
  3.3 BCA 法对重组PET30A-HA1-HUMAN 和PET30A-HA1-SWINE 蛋白定量测定的结果  37-38
  3.4 间接ELISA 方法的建立  38-42
    3.4.1 反应条件的优化  38-41
    3.4.2 特异性试验的结果  41
    3.4.3 重复性试验结果  41
    3.4.4 临界值的确定  41-42
  3.5 临床样本的检测及猪流感阳性血清的筛选  42-43
  3.6 检测结果的相关性分析  43-46
    3.6.1 猪血清检测结果的相关性分析  43
    3.6.2 人血清检测结果的相关性分析  43-44
    3.6.3 氨基酸序列比对结果  44-46
4 讨论  46-49
  4.1 PET30A-HA1 的原核表达  46
  4.2 间接ELISA 抗体检测方法的建立  46
  4.3 猪流感的血清学调查  46-47
  4.4 检测结果的相关性分析与序列比对结果  47-49
5 结论  49-50
参考文献  50-55
附录  55-61
致谢  61-62
攻读硕士学位期间撰写论文情况  62-63
附件  63

中国部分地区猪血清对甲型H1N1流感病毒的交叉免疫研究分析

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