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新甲型H1N1流感病毒小鼠致死模型的建立及初步研究

作　者: 朱云
导　师: 舒跃龙；周剑芳
学　校: 中国疾病预防控制中心
专　业: 病原生物学
关键词: 新甲型H1N1流感病毒致死株聚合酶突变致病性
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

2009年4月一种首发于北美的新甲型H1N1流感病毒导致了二十一世纪的第一次流感大流行,该病毒的八个基因节段分别来源于人流感病毒、禽流感病毒、古典猪流感病毒和欧亚系猪流感病毒,但是目前为止对于该病毒如何起源,又如何突破种属屏障适应人群并导致流感大流行的机制并不完全清楚。本课题的研究目的：1.建立新甲型H1N1流感病毒的小鼠致死模型。2.新甲型H1N1流感病毒在小鼠中的致病相关分子机制进行初步研究。研究内容：1.选用中国内地首例新甲型H1N1流感病例分离株A/sichuan/SWL1/2009 (H1N1)在小鼠模型上利用肺传肺传代方法建立新甲型H1N1流感病毒小鼠致死模型。2.对小鼠致死株噬斑纯化后进行全基因组分析,研究可能影响病毒毒力和宿主适应性的关键氨基酸位点,并通过反向遗传学的方法获得具有这些突变位点的重组病毒,研究其可能的致病机制。主要结果：1.A/Sichuan/SWL1/2009 (H1N1)简称SC/1)在小鼠模型上连续传代15代后,可使小鼠100%死亡,肺组织病理结果显示全肺弥漫性炎性反应,免疫细胞浸润及肺泡中透明质样渗出。2.噬斑纯化后的致死病毒株五个基因编码的PB2蛋白(PB2-D161N,PB2-H357N)、PA蛋白(PA-T32N、PA-A36T、PA-I38M)、血凝素蛋白(HA-G155E、HA-K163E、HA-G202W、HA-D222G和HA-R223Q)、神经氨酸酶(NA-Y56C)和基质蛋白(M-T1671)中的12个氨基酸位点发生突变；此外经噬斑纯化后的两株致死株第14代病毒2号和3号克隆的NA基因135-166位出现32个核苷酸的缺失,第15代病毒5号和6号克隆的NA基因135-167位出现33个核苷酸的缺失。3.聚合酶基因上PB2-H357N和PA-A36T的两个位点的突变都能增强病毒在人胚肾细胞(293T)上的聚合酶活性。4.病毒体外生长情况研究结果表明PA-A36T的突变对于病毒在人源和猪源细胞中的复制有明显的促进作用,而PB2-H357N的突变只能明显促进病毒在猪源细胞中的复制。5.小鼠感染实验结果表明PB2-H357N的突变能明显增加病毒在小鼠中的致病性,同时病毒在小鼠肺组织中的复制优于野生型病毒；PA-A36T的突变并不能明显增强病毒在小鼠中的致病性,也不能增强病毒在小鼠肺组织中的复制。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-12
第一部分新甲型H1N1流感病毒小鼠致死模型的建立  12-19
  1. 材料与方法  12-16
    1.1 病毒  12
    1.2 细胞  12
    1.3 实验动物  12
    1.4 试剂  12
    1.5 病毒血凝滴度及半数组织感染量的测定  12-14
    1.6 病毒在小鼠中传代  14
    1.7 传代病毒在MDCK细胞上的扩增  14
    1.8 小鼠致死性实验  14-15
    1.9 小鼠肺组织病理HE染色  15-16
  2. 结果  16-18
    2.1 病毒HA和TCID_(50)结果  16-17
    2.2 小鼠致死性实验结果  17
    2.3 小鼠肺组织病理结果  17-18
  3 小结  18-19
第二部分新甲型H1N1小鼠致死株的初步研究  19-36
  1. 材料  19-20
    1.1 质粒与细胞  19
    1.2 实验动物  19
    1.3 试剂  19-20
    1.4 引物合成和测序  20
  2. 方法  20-27
    2.1 噬斑纯化病毒  20-21
    2.2 病毒全基因组序列分析  21
    2.3 反向遗传技术拯救突变病毒  21-24
    2.4 基于Gaussia荧光素酶报告系统聚合酶活性测定  24-25
    2.5 重组病毒体外生长情况  25-26
    2.6 重组病毒小鼠致病性实验  26
    2.7 重组病毒小鼠致死性实验  26-27
  3 结果  27-34
    3.1 病毒全基因组序列分析结果  27-28
    3.2 反向遗传技术重组病毒的鉴定  28
    3.3 聚合酶活性测定  28-29
    3.4 重组病毒体外生长情况  29-32
    3.5 重组病毒的小鼠致死实验  32
    3.6 重组病毒对小鼠体重的影响  32-33
    3.7 重组病毒在小鼠体内的复制情况  33-34
  4 小结  34-36
第三部分讨论  36-40
结论  40-41
参考文献  41-45
综述  45-53
  参考文献  50-53
致谢  53
论文发表情况  53

新甲型H1N1流感病毒小鼠致死模型的建立及初步研究

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