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粪便提取液毒性检测方法的建立和应用

作　者: 孙丽凤
导　师: 赵立平
学　校: 上海交通大学
专　业: 微生物学
关键词: 粪便提取液细胞毒性遗传毒性肠道菌群
分类号: R446.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

人体肠道内共生着大量与之进行共代谢、共交换的微生物,其对人体健康产生重要影响。研究发现肠道菌群会对宿主肠道细胞产生具有细胞毒性、遗传毒性的物质。粪便提取液(fecal water,FW),是粪便经高速离心得到的液相组分,直接反映饮食结构以及人体自身、菌群代谢产物组分,间接反映菌群状态。研究表明粪便提取液具有细胞毒性、遗传毒性等活性作用,它可以反映人体内由于饮食结构不当及肠道菌群产生的毒性物质。Caco-2细胞是常用的肠上皮细胞体外研究模型,本文以Caco-2细胞为模型,利用单细胞凝胶电泳法建立粪便提取液对Caco-2细胞的遗传毒性检测方法,确定了该方法中Caco-2细胞最佳浓度为5×10~5cell/ml,碱性裂解液最佳裂解时间为60分钟,粪便提取液最佳作用浓度为80%。利用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测粪便提取液对Caco-2细胞的细胞毒性,通过确定该方法中最合适的Caco-2细胞浓度优化了该方法。利用建立好的粪便提取液毒性检测方法,首先研究了一套以肠道菌群为靶点的营养干预方案对80名肥胖志愿者粪便提取液毒性的影响。本实验室之前的研究结果显示,该营养干预方案干预9周后可以调节肥胖志愿者肠道菌群结构,并显著降低志愿者体重及改善其代谢综合症指征。本文的研究结果显示经过9周的营养膳食干预可以显著降低肥胖人群粪便提取液的细胞毒性(p<0.05)和遗传毒性(p<0.05)。利用spearman的方法对粪便提取液毒性数据与肠道菌群数据(OTU水平)作关联分析,得到13个OTU与粪便提取液细胞毒性有显著相关性,并且这13个OTU的丰度在干预9w后发生显著性差异。其次,我们对口服益生菌饮品(含活性乳酸菌)是否影响健康人粪便提取液毒性进行了研究。10名志愿者口服益生菌饮品3周后,DGGE图谱显示该菌可以到达人体肠道,肠道菌群16S rRNA基因454code测序数据分析结果显示饮用该益生菌饮品3周并没有明显改变志愿者肠道菌群整体结构及乳酸菌的含量。然而,饮用该益生菌饮品3周可以显著降低10名健康志愿者粪便提取液细胞毒性(p<0.05),粪便提取液遗传毒性亦有降低趋势。综上所述,本研究建立了粪便提取液对Caco-2细胞的细胞毒性、遗传毒性检测方法;以肠道菌群为靶点的营养干预方案可以显著降低肥胖志愿者的粪便提取液细胞毒性和遗传毒性;口服益生菌饮品可以显著改善健康人粪便提取液细胞毒性。我们建立的粪便提取液毒性检测方法可以分辨出粪便提取液毒性的差异,有效反映人体粪便提取液毒性状态,因而其可作为一个新的健康管理指标,应用于膳食干预或者药物治疗评价,并为研究肠道菌群影响人体健康的机理提供新的研究手段和思路。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-12
第一章文献综述  12-43
  1.1 粪便提取液及其生物活性  12-21
    1.1.1 粪便提取液的概念  12
    1.1.2 粪便提取液中的活性物质  12-15
      1.1.2.1 胆汁酸  13
      1.1.2.2 长链脂肪酸  13-14
      1.1.2.3 短链脂肪酸  14
      1.1.2.4 植物酚类物质  14
      1.1.2.5 N-亚硝基化合物  14-15
      1.1.2.6 其它物质  15
    1.1.3 粪便提取液的生物学活性  15-18
      1.1.3.1 粪便提取液细胞毒性  15-16
      1.1.3.2 粪便提取液遗传毒性  16
      1.1.3.3 粪便提取液对肠屏障功能的影响  16-17
      1.1.3.4 粪便提取液免疫毒性  17
      1.1.3.5 粪便提取液对基因表达的诱导作用  17-18
    1.1.4 影响粪便提取液生物活性的因素  18-21
      1.1.4.1 饮食对于粪便提取液生物活性的影响  18-20
      1.1.4.2 肠道菌群对粪便提取液活性的影响  20-21
  1.2 肠道菌群的功能及其与疾病的关系  21-30
    1.2.1 肠道菌群的概况  21-22
    1.2.2 肠道菌群的主要功能  22-24
      1.2.2.1 代谢作用（Metabolic functions）  23
      1.2.2.2 营养作用  23-24
      1.2.2.3 屏障保护作用  24
    1.2.3 影响肠道菌群结构的因素  24-25
    1.2.4 肠道菌群与疾病的关系  25-27
    1.2.5 研究肠道菌群结构的技术和统计学方法  27-30
      1.2.5.1 研究微生物群落结构的分子生物学技术  27-28
      1.2.5.2 研究微生物群落结构的多元统计学方法  28-30
  1.3 研究粪便提取液生物活性的技术  30-32
    1.3.1 四氮唑蓝比色分析法(MTT 法)  31
    1.3.2 单细胞凝胶电泳（彗星电泳comet assay）  31-32
  参考文献  32-43
第二章粪便提取液毒性检测方法的建立  43-56
  前言  43
  2.1 材料与方法  43-45
    2.1.1 实验样品  43-44
    2.1.2 主要试剂和仪器  44
    2.1.3 粪便提取液制备  44
    2.1.4 细胞培养  44
    2.1.5 单细胞凝胶电泳法检测粪便提取液遗传毒性  44-45
    2.1.6 MTT 法检测粪便提取液细胞毒性  45
  2.2 实验结果  45-52
    2.2.1 单细胞凝胶电泳-粪便提取液遗传度性检测方法的建立  45-49
      2.2.1.1 Caco-2 细胞浓度的确定  45-46
      2.2.1.2 碱性裂解液裂解细胞时间的确定  46-47
      2.2.1.3 遗传毒性检测中粪便提取液浓度的确定  47-49
    2.2.2 MTT 法-粪便提取液细胞毒性检测方法的优化  49-52
  2.3 讨论  52-54
  参考文献  54-56
第三章营养干预对肥胖者粪便提取液毒性的影响  56-78
  前言  56-57
  3.1 材料与方法  57-61
    3.1.1 样本来源  57-58
    3.1.2 粪便提取液的制备  58
    3.1.3 MTT 法检测粪便提取液细胞毒性  58
    3.1.4 单细胞凝胶电泳法检测粪便提取液遗传毒性  58-59
    3.1.5 肠道粪便菌群DNA 的165 rRNA 基因V3 区bar coded 454 测序  59-60
    3.1.6 统计方法  60-61
  3.2 结果  61-71
    3.2.1 粪便提取液制备情况  61
    3.2.2 膳食干预前后志愿者粪便提取液细胞毒性结果  61-63
    3.2.3 营养干预前后志愿者粪便提取液遗传毒性结果  63-65
    3.2.4 营养干预过程中粪便提取液毒性与菌群结构数据关联分析结果  65-71
  3.3 讨论  71-74
  参考文献  74-78
第四章口服益生菌饮品对健康人粪便提取液毒性的影响  78-96
  前言  78-79
  4.1 材料与方法  79-84
    4.1.1 益生菌饮品  79
    4.1.2 样本来源  79
    4.1.3 粪便提取液制备  79-80
    4.1.4 粪便肠道菌群总DNA 提取  80
    4.1.5 粪便肠道菌群总DNA 浓度测定  80-81
    4.1.6 乳酸菌类群特异性PCR-DGGE  81-82
    4.1.7 粪便肠道细菌的454 测序  82
    4.1.8 MTT 法粪便提取液细胞毒性检测  82
    4.1.9 单细胞凝胶电泳法粪便提取液遗传毒性检测  82-83
    4.1.10 数据分析  83-84
  4.2 结果  84-90
    4.2.1 乳酸菌特异性PCR-DGGE 结果  84-86
    4.2.2 饮用益生菌饮品2 个时间点肠道菌群的变化  86-88
    4.2.3 粪便提取液细胞毒性结果  88-89
    4.2.4 粪便提取液遗传毒性结果  89-90
  4.3 讨论  90-93
  参考文献  93-96
附录1 溶液试剂及培养液配方  96-97
附录2 仪器设配  97-99
附录3 缩写和全称  99-101
附录4 营养干预实验志愿者信息  101-104
附录5 营养干预实验样本粪便提取液细胞毒性数据  104-107
附录6 营养干预实验样本粪便提取液遗传毒性数据  107-108
附录7 口服益生菌干预实验样本粪便提取液细胞毒性数据  108-109
附录8 口服益生菌干预实验样本粪便提取液遗传毒性数据  109-110
致谢  110-112
研究生阶段已发表或录用的论文  112-115
附件  115

粪便提取液毒性检测方法的建立和应用

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