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菠菜中SOD的纯化及红景天滴丸中红景天苷的测定

作　者: 苟迎娣
导　师: 王骊丽
学　校: 西北大学
专　业: 分析化学
关键词: 高效液相色谱法天然活性成分红景天苷超氧化物歧化酶
分类号: TQ461
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

在现代分离科学的应用研究中,由于高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)具有高效、快速、灵敏度和纯化倍数高等优势,已经成为天然活性成分分析和分离的强有力工具。尤其是从复杂样品中如中草药有效成分、功能蛋白质、酶等生物大分子的分析和分离越来越趋向于快速、环保、低成本的分析、分离方法的建立。因此,本研究利用HPLC法,建立了中药制剂红景天滴丸中红景天苷的含量测定方法,同时对对菠菜中的超氧化物歧化酶(SOD)进行了分离纯化。本论文包括四个部分：1.文献综述：本章节综述了不同机理HPLC法,从一维和二维在线/离线LC联用技术在一些复杂样品分析和分离提取方面的进展及其应用。2.红景天滴丸中红景天苷的分离及其含量测定：利用HP-RPLC法对红景天滴丸中红景天苷进行定性和定量分析,包括色谱洗脱方式的选择、重复性、稳定性、加标回收率以及含量测定的考察,并定量测定不同溶剂中红景天滴丸中红景天苷的含量。结果显示,分别用水和甲醇作溶剂从红景天滴丸中提取红景天苷时,其提取率分别为9.25 mg/g和9.27 mg/g,因此,可用水取代甲醇做溶剂提取取红景天营,从而减少了有机溶剂使用造成的环境污染。3.菠菜中超氧化物歧化酶的粗分离：优化了菠菜中SOD的提取条件,包括提取液的pH、料液比以及SOD粗酶液分离纯化中加热的温度和丙酮的用量,并对测活方法进行筛选,建立了从菠菜中超氧化物歧化酶的粗分离方法。结果在获得的最佳优化条件下,SOD比活力可达72.38 U/mg,纯化倍数为4.2。采用同功酶电泳对菠菜中的SOD进行同功酶鉴定,结果证明菠菜中的SOD主要为Cu,Zn-SOD;通过SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS测定菠菜中的Cu,Zn-SOD分子量为31.8 kDa,亚基分子量为19.8 kDa。4. HPLC法分离纯化超氧化物歧化酶：分别利用HPHIC法和HPIEC法以及HPHIC-SEC法对SOD粗酶液进行精纯化,并对几种方法进行比较。结果用HPHIC分离后,比活力为119.82 U/mg,纯化倍数为7.8,活性回收率为34.3%; HPIEC法分离后比活力为159.92 U/mg,纯化倍数为10.7,活性回收率为43.6%；而采用HPHIC-SEC二维离线模式分离后比活力为284.65 U/mg,纯化倍数为19.0,活性回收率为60.5%。因此,离线HPHIC-SEC模式分离纯化SOD可获得最大的活性回收率和纯化倍数。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章文献综述  10-17
  1.1 前言  10-11
  1.2 复杂样品中分离纯化的HPLC法  11-14
    1.2.1 HPIEC  11
    1.2.2 HPHIC  11-12
    1.2.3 HPSEC  12
    1.2.4 HPAFC  12-13
    1.2.5 HP-RPLC  13-14
  1.3 各种HPLC法的离线和在线联用技术  14-16
  1.4 本论文的研究工作  16-17
第二章红景天滴丸中红景天苷的HPLC法分离和分析  17-25
  2.1 引言  17-18
    2.1.1 仪器  18
    2.1.2 试剂  18
  2.2 实验方法  18-19
    2.2.1 色谱条件  18
    2.2.2 标准品溶液的制备  18-19
    2.2.3 样品溶液的制备  19
  2.3 结果与讨论  19-23
    2.3.1 色谱条件的确定  19
    2.3.2 标准曲线的制作及其线性关系  19-20
    2.3.3 精密度  20
    2.3.4 重复性  20-21
    2.3.5 稳定性  21
    2.3.6 加标回收率  21-22
    2.3.7 该方法对样品中红景天苷的分离  22-23
  2.4 本章小结  23-25
第三章菠菜中超氧化物歧化酶的提取及粗分离  25-36
  3.1 引言  25-26
  3.2 仪器与试剂  26-27
    3.2.1 仪器  26-27
    3.2.2 试剂  27
  3.3 实验方法  27-31
    3.3.1 溶液的配制  27-28
    3.3.2 粗酶液的制备  28
    3.3.3 含量测定  28-29
    3.3.4 SOD活性的测定  29-30
    3.3.5 SOD类型的确定  30
    3.3.6 粗酶提取液的分析  30-31
  3.4 结果与讨论  31-35
    3.4.1 料液比对提取效果的影响  31
    3.4.2 pH值对分离提取效果的影响  31-32
    3.4.3 对菠菜中富含SOD组织的确定  32
    3.4.4 粗分离菠菜中SOD的热变性  32-33
    3.4.5 丙酮加入量对SOD提取效果的影响  33-34
    3.4.6 同功酶谱带法鉴定菠菜中SOD的类型  34-35
  3.5 本章小结  35-36
第四章菠菜中超氧化物歧化酶的分离纯化  36-44
  4.1 引言  36-37
  4.2 LC法分离与纯化粗提取的SOD  37-38
    4.2.1 色谱条件  37
    4.2.2 色谱馏分的分析  37-38
  4.3 结果与讨论  38-43
    4.3.1 HPHIC法分离纯化菠菜中SOD  38-40
    4.3.2 HPIEC法分离纯化菠菜中SOD  40-41
    4.3.3 HPHIC-SEC法分离纯化菠菜中SOD  41-43
  4.4 本章小结  43-44
论文总结  44-45
参考文献  45-52
硕士期间论文发表情况  52-53
致谢  53

菠菜中SOD的纯化及红景天滴丸中红景天苷的测定

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