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日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶两种同工酶的相关研究

作　者: 孔娟
导　师: 胡薇
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶同工酶转录表达
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

曰本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶(SjAPRT)是血吸虫嘌呤补救途径中的关键酶,它催化腺嘌呤生成腺苷一磷酸(AMP)。已有文献报道在日本血吸虫鉴定出两条编码APRT的基因序列SjAPRT1和SjAPRT2 (GenBank Accesion: AAW24796,AAW25340)。本研究在已有序列的基础上通过RT-PCR获得了日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶两条基因(SjAPRTs)并利用Real time PCR及Western blotting技术分析其在日本血吸虫各虫期转录水平和蛋白水平差异。将目的基因亚克隆至载体pET28a,转化至大肠埃希菌BL21菌株进行诱导表达,纯化的蛋白免疫小鼠Western blotting分析其免疫反应性,并进行动物实验了解其保护性效果。以纯化的rSjAPRTs作为包被抗原通过ELISA方法评估其免疫诊断价值。RT-PCR扩增结果显示在虫卵、尾蚴、童虫和成虫均检测到SjAPRT1及SjAPRT2基因转录本,Real time PCR结果显示SjAPRTs在各虫期的转录水平存在一定差异,在成虫及虫卵期的表达量均为童虫期的2倍左右。Western blotting分析结果表明在虫卵、童虫和成虫中检测到rSjAPRTl多抗兔血清特异性识别条带,尾蚴中未检测到特异性条带；而在尾蚴和童虫中检测到rSjAPRT2多抗兔血清特异性识别条带,成虫中识别条带较弱。这一结果暗示SjAPRTs的两种同工酶可能在血吸虫不同发育阶段发挥作用,而SjAPRT 1在成虫中发挥主要作用。此外纯化的重组蛋白rSjAPRTs可被日本血吸虫感染兔血清识别,表明其具有一定的免疫反应性。以rSjAPRTl, rSjAPRT2作为包被抗原检测日本血吸虫病人血清的间接ELISA方法结果显示检测疫区病人血清的敏感性分别为60%,63.3%,非疫区正常人血清特异性分别为96.6%,93.3%。动物保护性实验结果显示rSjAPRT1免疫小鼠后可诱导产生13.6%的减虫率和14.4%的肝脏减卵率。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第1章绪论  11-20
  1.1 血吸虫和血吸虫病  11-12
    1.1.1 血吸虫的种类、分布及生活史  11
    1.1.2 血吸虫病的流行情况  11
    1.1.3 日本血吸虫及生活史  11-12
  1.2 血吸虫相关的疫苗和诊断的研究  12-16
    1.2.1 血吸虫疫苗研究  12-14
      1.2.1.1 天然制备的疫苗  13
      1.2.1.2 基因重组疫苗  13
      1.2.1.3 核酸疫苗  13-14
      1.2.1.4 表位疫苗和合成肽疫苗  14
      1.2.1.5 多价疫苗或多基因疫苗  14
    1.2.2 血吸虫病免疫诊断的研究进展  14-16
      1.2.2.1 皮内实验  14-15
      1.2.2.2 环卵沉淀实验(COPT)  15
      1.2.2.3 酶联免疫吸附实验  15
      1.2.2.4 胶体染料试纸条法  15
      1.2.2.5 血吸虫病免疫诊断用抗原和抗体  15-16
        1.2.2.5.1 天然抗原  15-16
        1.2.2.5.2 重组抗原  16
  1.3 吸虫嘌呤代谢研究进展  16-18
    1.3.1 血吸虫嘌呤代谢  16-17
    1.3.2 血吸虫嘌呤代谢中相关的酶类  17-18
      1.3.2.1 嘌呤核苷磷酸化酶  17
      1.3.2.2 磷酸核糖转移酶  17-18
  1.4 本研究背景内容及意义  18-19
    1.4.1 本研究选题背景  18
    1.4.2 研究内容及意义  18-19
  1.5 本研究的技术路线  19-20
第2章 SjAPRTs的生物信息学分析  20-25
  2.1 引言  20
  2.2 材料及方法  20
  2.3 结果与讨论  20-25
    2.3.1 SjAPRTs基因及其编码蛋白的一些性质和特征  20-21
    2.3.2 同源性分析  21-22
    2.3.3 同源性分析  22-25
第3章 SjAPRTs基因的克隆与原核表达及纯化  25-39
  3.1 引言  25
  3.2 材料  25-27
    3.2.1 所用载体与菌株  25
    3.2.2 主要试剂与仪器  25-26
    3.2.3 部分试剂的配方  26-27
  3.3 方法  27-33
    3.3.1 重组质粒的构建  27-30
    3.3.2 重组基因在大肠杆菌中的表达和纯化  30-33
  3.4 结果和讨论  33-39
    3.4.1 外源基因片段的制备  33-34
    3.4.2 pET28a载体片断的制备  34-35
    3.4.3 重组质粒的PCR鉴定  35
    3.4.4 阳性克隆的表达和重组蛋白溶解性鉴定  35-36
    3.4.5 重组蛋白的纯化  36-39
第4章 SjAPRTs在不同虫期转录和表达差异的研究  39-53
  4.1 引言  39
  4.2 SjAPRTs各虫期转录差异的研究  39-40
    4.2.1 不同虫期材料及免疫多抗兔血清的制备  39
    4.2.2 主要试剂与仪器  39-40
    4.2.3 部分试剂的配方  40
  4.3 方法  40-44
    4.3.1 各虫期总RNA的抽提  40-41
    4.3.2 cDNA模板制备方法  41
    4.3.3 PCR引物的设计与合成  41
    4.3.4 PCR扩增各虫期SjAPRTs基因序列  41-42
    4.3.5 Realtime PCR分析SjAPRTs基因在各个虫期的相对表达情况  42
    4.3.6 Real time PCR标准曲线的绘制  42
    4.3.7 相对表达指数的确定  42-43
    4.3.8 不同虫期总蛋白的抽提  43
    4.3.9 Western blotting检测SjAPRTs在各虫期的表达情况  43-44
  4.4 结果与讨论  44-53
    4.4.1 总RNA的抽提与鉴定  44
    4.4.2 各虫期RT-PCR结果  44-45
    4.4.3 Real-time PCR分析SjAPRTs各虫期转录本水平差异  45-50
      4.4.3.1 标准曲线的构建  45-50
      4.4.3.2 不同虫期相对表达指数的确定  50
    4.4.4 SjAPRTs在不同虫期蛋白表达差异结果  50-53
      4.4.4.1 不同虫期总蛋白SDS-PAGE电泳分析  50-51
      4.4.4.2 SjAPRTs各虫期蛋白表达差异  51-53
第5章 sjrAPRTs免疫原性分析免疫保护性的研究及诊断价值的初步评价  53-61
  5.1 引言  53
  5.2 材料  53-55
    5.2.1 实验用重组蛋白、感染动物血清及试验动物  53
    5.2.2 主要试剂与仪器  53-54
    5.2.3 部分实验试剂的配方  54-55
  5.3 方法  55-57
    5.3.1 rSjAPRTs免疫反应性分析  55
    5.3.2 动物保护性实验方案  55-56
    5.3.3 间接ELISA法检测感染血清中的抗体  56-57
  5.4 结果与讨论  57-61
    5.4.1 rSjAPRTs Western blot检测免疫反应性结果  57-58
    5.4.2 SjAPRTl动物保护性实验结果  58
    5.4.3 ELISA实验结果  58-61
      5.4.3.1 rSjAPRTs包被浓度的确定  58-60
      5.4.3.2 间接ELISA方法检测疫区病人血清的敏感性与特异性  60-61
结论  61-62
参考文献  62-65
致谢  65

日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶两种同工酶的相关研究

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