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湖羊ESR基因的检测及基因型与多胎性能的关系

作　者: 董文艳
导　师: 俞颂东
学　校: 浙江大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 湖羊 ESR基因多胎基因荧光PCR PCR-SSCP
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

雌激素受体(estrogen receptor, ESR)是一种配体激活转录因子家族中的核酸受体。研究报道,猪雌激素受体基因中的优势等位基因B基因可能与猪的高产仔数密切相关,利用该优势等位基因进行育种,可加速猪群的遗传进展。已有研究结果表明,ESR基因可能是控制小尾寒羊多胎性能的一个主效基因或与之存在紧密的遗传连锁。但目前尚无研究证实湖羊ESR基因的群体遗传效应及ESR基因的多态性与湖羊产羔数的相关性。本研究拟克隆湖羊ESR基因,应用PCR-SSCP、实时荧光PCR方法研究湖羊ESR基因多态性及其群体遗传学特征；通过数量遗传学分析方法研究ESR基因的多态性与湖羊产羔数的相关性；并建立湖羊ESR基因的实时荧光PCR检测方法。1.应用PCR-SSCP技术分析高繁殖力绵羊品种湖羊的雌激素受体基因第一外显子部分序列的单核苷酸多态性。结果表明：湖羊ESR基因存在3种基因型：野生纯合型(AA)、突变纯合型(BB)、突变杂合型(AB)。2.对检测到的纯和基因型(AA、BB)进行克隆测序,BB基因型和AA基因型相比,BB基因型检测到1处碱基突变(C→G)。比对BB基因型序列与GenBank(登录号：X98010)公布的绵羊ESR基因的第一外显子序列,仅在第363位点有突变(C→G),其余各碱基序列相同。3.检测56只湖羊ESR基因的多态性,其中AA型为15只,AB型为32只,BB型为9只。统计结果显示,A基因频率为0.554,B基因频率为0.446,AA基因型频率为0.262,AB基因型频率为0.571,BB基因型频率为0.161,表明了湖羊ESR基因的多态性。经x2检验表明,湖羊群体的基因频率和基因型频率都达到了Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。揭示ESR基因这个位点可能不受选育措施的影响,在选育过程中的遗传仍然是随机的。4.结果表明,湖羊ESR基因AB或BB基因型产羔数分别比AA基因型多0.98只(P<0.01)、1.47只(P<0.01),湖羊产羔数的最小二乘平均值分别为AA型1.20,AB型2.18,BB型2.67。湖羊产羔数的数量统计显示,该湖羊群体的AA型与BB型之间产羔数差异极显著(P<0.01),AA型与AB型之间产羔数差异极显著(P<0.01),BB型与AB型之间产羔数差异显著(P<0.05),ESR基因的B等位基因与湖羊高产羔数呈显著正相关。同时湖羊ESR基因的B等位基因对A等位基因的显性度为0.333。5.随机选用PCR-SSCP技术测得的ESR基因的AA、BB和AB三种基因型的样品各8个,进行SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法检测,并分析其溶解曲线和Tm值。检测结果显示,实时荧光PCR方法可检测出所有的BB基因型和AB基因型样品,和7个AA基因型的样品,检测率达96%。上述结果证实,ESR基因可能是控制湖羊多胎性能的一个主效基因或是与之存在紧密的遗传连锁,并建立了湖羊ESR基因实时荧光PCR方法群体检测技术,可为应用早期选育提高湖羊的繁殖性能提供理论依据和技术途径。

全文目录

致谢  5-9
中文摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
第一章文献综述  13-32
  1 绵羊高繁殖力机制的研究现状  13-19
    1.1 影响绵羊高繁殖力的生殖生理因素  13-15
      1.1.1 内分泌机制  13-14
      1.1.2 排卵数  14-15
      1.1.3 子宫保胎能力  15
      1.1.4 胚胎存活率  15
    1.2 绵羊高繁殖力主效基因的研究现状  15-19
      1.2.1 ESR基因  15-17
      1.2.2 FECB基因  17
      1.2.3 FECX基因  17-18
      1.2.4 GDF9基因  18
      1.2.5 WOODLAND基因  18-19
  2 湖羊高繁殖力的研究现状  19-21
    2.1 湖羊多胎的生殖生理  19-20
    2.2 湖羊高繁殖力候选基因的研究进展  20-21
  3 雌激素受体基因与繁殖性能关系的研究概况  21-25
    3.1 雌激素受体的生物学作用及分布  21-22
    3.2 雌激素受体基因与生殖器官发育特性的关系  22-23
    3.3 雌激素受体基因在胚胎发育中的表达  23-24
    3.4 雌激素受体基因对猪初生重和乳头数的影响  24
    3.5 雌激素受体基因对绵羊繁殖性能影响的研究  24-25
    3.6 雌激素受体基因多态性的研究现状  25
  4 基因多态性分析的分子遗传标记方法  25-31
    4.1 单链构象多态性分析  25-27
      4.1.1 PCR-SSCP方法的原理  26
      4.1.2 PCR-SSCP的特点  26-27
      4.1.3 PCR-SSCP方法的应用现状  27
    4.2 实时荧光PCR方法  27-31
      4.2.1 实时荧光PCR方法的原理  28
      4.2.2 实时荧光PCR方法的特点  28-29
      4.2.3 实时荧光PCR方法分类  29
      4.2.4 实时荧光PCR方法突变检测的应用  29-31
  5 本研究的目的与意义  31-32
第二章材料与方法  32-48
  1 实验材料  32-35
    1.1 实验湖羊来源及采样方法  32
    1.2 药品和酶  32-33
    1.3 主要仪器设备  33
    1.4 有关试剂和溶液的配制  33-35
  2 实验方法  35-48
    2.1 湖羊血液DNA的提取  35
    2.2 DNA浓度和纯度的检测  35-36
      2.2.1 DNA浓度和纯度的测定  35-36
      2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测  36
    2.3 PCR-SSCP和实时荧光PCR分析ESR基因的程序  36-41
      2.3.1 引物的设计  36
      2.3.2 引物溶液的配制  36
      2.3.3 PCR反应体系及反应条件  36-37
      2.3.4 SSCP检测步骤  37-40
        2.3.4.1 PCR扩增产物的电泳  37-39
        2.3.4.2 SYBR GREEN染色  39
        2.3.4.3 SSCP结果的分型  39-40
      2.3.5 实时荧光PCR检测步骤  40-41
        2.3.5.1 实时荧光PCR反应体系及反应条件  40-41
        2.3.5.2 实时荧光PCR产物分析  41
    2.4 ESR基因第一外显子突变区的纯合子个体的克隆测序  41-45
      2.4.1 目的片段的回收  41-42
      2.4.2 连接反应  42-43
      2.4.3 感受态细胞的制备—氯化钙法  43-44
      2.4.4 转化  44
      2.4.5 质粒DNA的小规模提取—碱裂解法  44-45
      2.4.6 重组质粒的鉴定  45
    2.5 统计分析方法  45-48
      2.5.1 群体基因频率和基因型频率的计算  45-46
      2.5.2 湖羊ESR基因位点HARDY-WEINBERG平衡状态的检验  46
      2.5.3 检验公式  46
      2.5.4 湖羊ESR基因型的独立性检验  46
      2.5.5 湖羊ESR基因位点与湖羊繁殖力关系的分析  46-48
第三章湖羊ESR基因多态性检测的结果与分析  48-55
  1 基因组的提取  48
  2 ESR基因的SSCP电泳结果分析  48-49
  3 ESR基因的PCR扩增产物电泳  49
  4 ESR基因的实时荧光PCR检测  49-52
  5 湖羊ESR基因测序分析结果  52
  6 ESR基因的遗传效应分析  52-55
    6.1 湖羊ESR基因频率和基因型频率  52-53
    6.2 不同ESR基因基因型的湖羊产羔数的最小二乘平均值及标准误(表3-2)  53-54
    6.3 湖羊群体ESR基因HARDY-WEINBERG平衡状态的检验(表3-3)  54-55
第四章讨论  55-59
  1 ESR基因在湖羊中的多态性及基因型分布  55
  2 ESR基因与湖羊产羔数的关系  55-56
  3 检测湖羊ESR基因多态性的实时荧光PCR方法的初步建立  56-59
第五章结论  59-60
创新点  60-61
参考文献  61-71
缩略词表  71

湖羊ESR基因的检测及基因型与多胎性能的关系

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