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禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

作　者: 董施伟
导　师: 周恩民
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽戊型肝炎 禽戊型肝炎病毒 单克隆抗体 免疫组化
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


禽戊型肝炎(HEV)是由禽戊型肝炎病毒(Avian Hepatitis E Virus)感染所致的病毒肝炎,主要经肠道传播,临床症状表现为为肝脾肿大,肝坏死,肝出血,卵巢退化,死亡率上升及产蛋率下降等。2001年,Haqshenas等从患有肝脾肿大(hepatitis-splenomegaly, HS)综合症的鸡胆汁中首次分离出禽HEV。自禽HEV发现以来,对禽HEV血清流行病学的调查已有了数篇的报道,但由于禽HEV和人、猪HEV ORF2抗体的交叉反应,使得血清学的调查一直处于初级阶段。禽HEV ORF2基因序列同人、猪HEV的同源性为48-49%,其中ORF2蛋白中最保守的区域位于aa339-606。将本实验室保存的禽HEV ORF2-1重组质粒转入大肠杆菌原核表达禽HEV ORF2-1蛋白(aa339-564),经过提纯后免疫小鼠,经常规的细胞融合和亚克隆制备出6株禽HEV ORF2-1蛋白的单克隆抗体(7H12, 3E8, 1B5, 1H5, 3A1和6G8)。利用9段ORF2截短的蛋白(ORF2-1~9)和8个多肽,通过间接ELISA方法,确定6株单抗7H12, 3E8, 1B5, 1H5, 3A1和6G8分别识别aa339-355, aa355-384, aa355-384, aa384-414, aa389-398和aa510-516。3E8和1B5两株单抗识别同一抗原表位区aa355-383,但这一抗原表位区含有28aa,为了区别3E8和1B5,将3E8用HRP标记后做竞争ELISA,竞争ELISA结果显示3E8和1B5两株单抗识别两个不相互重叠的抗原表位。2009年,赵钦等从中国患有大肝大脾的鸡胆汁中首次分离出禽HEV,将中国株禽HEV攻毒SPF鸡,采集攻毒后粪便、血清等。利用6株单抗采用免疫捕获病毒方法去捕获攻毒后粪便中的禽HEV,其中7H12和1H5两株单抗可以捕获到病毒,进一步通过免疫组化实验证明7H12和1H5可以检测到攻毒鸡的器官中有禽HEV ORF2蛋白的存在。本实验制备出的6株单克隆抗体为研究禽、人和猪HEVs血清学调查提供了良好的物质基础。同时,7H12和1H5两株单抗可以捕获禽HEV病毒为禽HEV的确诊提供了理论依据。

全文目录


中文摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-30
  1.1 戊型肝炎的概况  11-21
    1.1.1 戊型肝炎病毒的病原学  11-12
    1.1.2 戊型肝炎病毒的基因组结构  12-13
    1.1.3 病毒的宿主范围与增殖  13-14
    1.1.4 戊型肝炎的流行病学  14-18
    1.1.5 检测方法  18-19
    1.1.6 疫苗的研制  19-21
  1.2 禽戊型肝炎病毒的研究进展  21-27
    1.2.1 禽戊型肝炎病毒病原学  21-22
    1.2.2 禽戊型肝炎病毒流行病学研究状况  22
    1.2.3 禽戊型肝炎病毒免疫学研究状况  22-27
  1.3 本研究的目的与意义  27-30
2 材料与方法  30-53
  2.1 材料  30-36
    2.1.1 菌株和质粒  30
    2.1.2 载体  30-31
    2.1.3 实验动物及病毒株  31
    2.1.4 工具酶和主要试剂  31-32
    2.1.5 主要仪器  32
    2.1.6 溶液的配制  32-36
  2.2 方法  36-53
    2.2.1 禽 HEV ORF2-1 重组质粒的鉴定  36-38
    2.2.2 禽 HEV ORF2-1 蛋白的表达与纯化  38-41
    2.2.3 禽 HEV ORF2s 蛋白的设计、构建、表达、鉴定和纯化  41-43
    2.2.4 小鼠的免疫  43-44
    2.2.5 免疫小鼠抗体效价的测定  44-45
    2.2.6 单克隆抗体的制备  45-48
    2.2.7 单克隆抗体的鉴定  48-53
3 结果与分析  53-65
  3.1 禽HEV ORF2-1 重组质粒的鉴定  53-54
    3.1.1 重组质粒禽HEV ORF2-1 的酶切鉴定  53
    3.1.2 重组质粒禽HEV ORF2-1 基因测序  53-54
  3.2 禽HEV ORF2-1 蛋白的表达与鉴定  54-56
    3.2.1 禽HEV ORF2-1 蛋白的表达  54-55
    3.2.2 禽HEV ORF2-1 蛋白的Western blot 鉴定  55-56
  3.3 禽 HEV ORF2s 蛋白的设计  56-57
    3.3.1 禽HEV ORF2-1 蛋白的分析  56
    3.3.2 禽 HEV ORF2s 引物的设计  56-57
  3.4 禽 HEV ORF2s 蛋白纯化和鉴定  57-58
    3.4.1 禽 HEV ORF2s 蛋白的纯化  57-58
    3.4.2 禽 HEV ORF2s 纯化蛋白的鉴定  58
  3.5 免疫小鼠抗体效价检测  58-59
  3.6 抗禽 HEV ORF 2-1 蛋白特异性单克隆抗体细胞的筛选  59
  3.7 单抗腹水的制备与纯化  59-61
    3.7.1 单抗腹水的效价测定  59-60
    3.7.2 单抗腹水的纯化  60-61
  3.8 单克隆抗体的鉴定  61-65
    3.8.1 单抗的特异性鉴定  61-62
    3.8.2 单抗亚型的鉴定  62-63
    3.8.3 单克隆抗体的功能鉴定  63-65
4 讨论  65-68
  4.1 禽 HEV ORF2s 的表达和纯化  65
  4.2 单克隆抗体的制备与鉴定  65-68
5 结论  68-69
6 参考文献  69-79
7 致谢  79-80
8 攻读学位期间发表论文情况  80

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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