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抗Aβ人源性抗体的制备

作　者: 孙超
导　师: 俞炜源
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: 阿尔茨海默病 β样淀粉蛋白抗体表位
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

阿尔茨海默病( Alzheimer’s disease, AD)是一种多发于老年人群的中枢神经系统退行性疾病,主要临床特征为记忆衰退、认知及运动功能产生障碍等。随着全球人口老龄化的加剧,阿尔茨海默病的发病几率正在不断上升,由此引发的一系列社会问题正在日益加剧。目前对于AD的发病尚缺乏有效的治疗手段,因此研制能够治疗AD的特效药物具有重要的意义。现阶段关于AD的发病机理还不十分清楚,其中β样淀粉蛋白(β-amyloid protein,Aβ)由正常生理状态下的可溶性单体形式聚集为具有神经细胞毒性的淀粉样蛋白沉积被认为是在AD发病过程中的关键事件。有研究表明:Aβ是各种因素引起阿尔茨海默病的共同途径,是AD发病和发展的关键因素,因此Aβ被普遍认为是治疗AD的有效靶分子。Aβ是由主要存在于脑组织中的β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein ,APP)经过β代谢途径形成的。一般由39～43个氨基酸组成,具有一个β折叠片层的二级结构,分子整体呈现疏水性,容易聚集,形成不溶性沉积。1999年,Schenk等首次应用Aβ1-42对AD模型小鼠进行主动免疫取得了突破性进展。此后陆续有研究报道证实Aβ肽段及其抗体可应用于AD的免疫治疗,并能够得到很好的治疗效果。由Elan公司研制的Aβ1-42疫苗Betabloc(AN1792)经过I期临床试验后,发现Betabloc能有效的激发免疫应答,产生与Aβ淀粉样沉积结合的抗体,能够有效的激活小胶质细胞清除Aβ淀粉样沉积形成的斑块,并且显著改善患者的认知功能。但遗憾的是,在Ⅱ期临床实验过程中,部分患者脑部出现炎症反应,试验被迫终止。与此同时对于AD的被动免疫治疗方面取得了巨大的进展,研究证实应用抗AβN端抗体可以有效地改善AD的相关症状,并且不会引发Th1细胞的免疫反应。Elan和惠氏公司联合研制的抗AβN端的人源化抗体Bapineuzumab是第一个开发用于治疗AD的抗体,目前正在进行Ⅲ期临床试验。本研究中,我们希望以Aβ1-42及其N端(Aβ1-12、Aβ1-15)为靶标分子通过采用细菌筛选结合固相筛选等多种筛选方案对大容量人源性噬菌体抗体库进行筛选以获得特异性抗体,为开发AD的治疗性抗体奠定基础。首先,本研究中为了针对Aβ1-12进行抗体筛选以及为筛选获得的特异性抗体进行初步的表位鉴定提供表位肽段,我们根据Aβ1-42的分子结构及细菌鞭毛表面展示系统的特点,将Aβ1-42分为Aβ1-12、Aβ12-23、Aβ21-32、Aβ31-42四种表位肽段,分别构建可表达四种肽段与细菌鞭毛蛋白融合表达的重组质粒,并利用细菌鞭毛表面展示系统将其分别表达于E.coli GI826鞭毛上。SDS-PAGE电泳、Western blot及免疫荧光鉴定结果证明了四种Aβ抗原表位肽段与鞭毛蛋白融合表达并成功的展示于E.coli GI826表面。其次,我们对Aβ1-42及其N端(Aβ1-12、Aβ1-15)进行了人源性抗体的高通量筛选。目前AD被动免疫研究所应用的抗体多为鼠源性抗体,限制了其在人体中的应用。而从人源性抗体库中获得的抗体则避免了这一问题,可不经人源化改造直接应用于人体。本研究中我们分别采用了针对Aβ1-12的细菌扣除筛选、针对Aβ1-42的固相筛选、针对Aβ1-12的细菌固相结合筛选、以及针对Aβ1-15的固相筛选四个筛选方案对库容量可达1.35×1010的大容量全合成人源性噬菌体单链抗体库进行了特异性抗体的筛选,实现了抗体的高通量筛选。在筛选过程中共随机挑选、鉴定了约2000个克隆,其中细菌筛选克隆阳性率较低,固相筛选克隆阳性率可达50%,但是由于固相筛选是针对Aβ1-42全长进行筛选,获得的特异性抗体可能与Aβ1-42的任意区域结合。为了针对AβN端进行高质量的抗体筛选,我们采用了先针对Aβ1-12进行细菌扣除筛选再应用Aβ1-42进行固相筛选的方案,针对Aβ1-12进行了细菌固相结合筛选,克隆阳性率可达40%。与此同时我们也针对Aβ1-15进行了固相筛选,但克隆阳性率较低。最终我们在细菌筛选过程中,获得了一株特异性噬菌体抗体G10。在Aβ1-42固相筛选过程中,获得了两株特异性噬菌体抗体18、26。在细菌固相结合筛选过程中我们获得了两株特异性噬菌体抗体H9、B5。在Aβ1-15固相筛选过程中获得了一株特异性抗体87。其中18与H9为同一株抗体,这一结果证明了我们所采用的方案可靠且有效。再次,我们将获得的特异性单链抗体改造为全抗体形式并对获得瞬时表达的全抗体进行了特异性鉴定。为了获得稳定性更好的抗体形式,我们对筛选得到的5株特异性噬菌体单链抗体进行了全抗体形式的改造,并对这5株全抗体在293-F细胞中进行了瞬时表达。结果18及87号抗体未能得到表达,G10、26、B5获得了表达。特异性鉴定结果发现G10失去了与Aβ1-42的结合能力,26、B5能与Aβ1-42特异性结合,最终我们获得了26和B5两株特异性的全抗体。最后,我们对26和B5这两株全抗体进行了表位鉴定,并对能与AβN端(Aβ1-12、Aβ1-15)结合的抗体进行了亲和力检测。利用细菌鞭毛表面展示的Aβ分段肽段对26和B5进行了表位鉴定,结果显示26与Aβ31-42特异性结合,B5与Aβ1-12特异性结合,因此初步认为26的抗原表位位于Aβ31-42,B5的抗原表位位于Aβ1-12。非竞争ELISA结果显示B5亲和力为KD=1.4×10-8mol/L综上所述,我们建成了Aβ1-42分段表位肽段的细菌鞭毛展示系统,为今后对Aβ的表位研究工作打下了基础,并且成功通过抗体库的高通量筛选从大容量人源性噬菌体抗体库中,获得了两株特异性单链抗体26和B5,在全抗体水平上进行表位鉴定,可初步认为26的表位位于Aβ31-42内,B5的表位位于Aβ1-12内,同时测得B5全抗体亲和力为KD=1.4×10-8mol/L,为进一步深入研究AD的治疗性抗体奠定基础。

抗Aβ人源性抗体的制备

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