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构建含有小IRES和报告基因的新型HCV亚基因复制子细胞系

作　者: 高香翠
导　师: 孙殿兴
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 丙型病毒性肝炎亚基因复制子内源性核糖体结合位点新霉素磷酸转移酶海肾荧光素酶
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染率占全世界人口的1%-2%,约占我国人口的3.2%,是急慢性肝病的主要致病因素之一,约70%-80%的感染者转为慢性,其转归和肝硬化及肝细胞癌有密切关系,在美国,HCV感染已经成为重症肝病晚期进行肝移植的最主要原因。由于其高流行性、病程的隐匿性和长期感染导致预后不良,丙型病毒性肝炎成为一个严重的医学和社会经济学问题。HCV是黄病毒科、丙型肝炎病毒属的唯一成员,在1989年就被鉴定出来,并且引起了对HCV基因结构、病毒蛋白结构和生化特征研究的热潮。但由于HCV基因组有显著的序列变异,尤其是在E2包膜蛋白编码区的高变区,在全球范围内HCV的基因型多达30个,另一方面HCV在体外自主复制水平极低,且其唯一的可感染动物为黑猩猩,故缺少有效的细胞培养系统和经济的小动物模型来研究HCV复制及其致病机制,严重阻碍了对HCV生命周期和筛选抗病毒药物的研究。为克服这一困难,研究者们进行了大量的实验探索,直到1999年才有了突破性的进展：建立了一个有效的细胞培养模型—HCV复制子系统(HCV Replicon System)。这个系统的基础是利用基因工程构建的亚基因组HCV RNA转染人肝癌细胞系Huh-7细胞,且可在此细胞中自主复制。内源性核糖体结合位点(Internal Ribosome Entry Site, IRES)是具有高级结构RNA片段,负责细胞性蛋白翻译结构的形成和病毒蛋白产物的合成。虽然病毒mRNA的IRES结构精密且有数百个核苷酸组成,但是有一系列的证据表明小片段的核苷酸序列,无论是自然形成还是人工合成,都能够发挥起始翻译的功能。Chappell等报道,分析RNA结合域蛋白3(Rbm3)的结构,发现一个仅22nt的小区段能够发挥更为强大的IRES功能,比目前常用的EMCV IRES强10倍。利用这个小IRES,可以减少mRNA的长度,如何用在HCV复制子的构建,将减少插入序列的长度,从而能够构建一个高效表达HCV RNA并能够表达抗性基因和报告基因的新型HCV亚基因复制子。报告基因(Reporter Gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,也就是说,是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。可通过IRES或与其它目的基因相融合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控,筛选得到转化体。诸如海肾荧光素酶报告基因(Renilla Luciferase Reporter Gene)、萤火虫荧光素酶报告基因(Firefly Luciferase Reporter Gene)、β-内酰胺酶报告基因(Beta Lactamase Reporter Gene)、和反式诱导产生的分泌性碱性磷酸酶报告基因(Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Gene)已经被广泛应用于检测HCV复制子RNA的复制与表达情况。其中荧光素酶报告基因系统是最常用、最精确地一种。荧光素酶活性和复制子RNA复制水平直接相关,说明其是一个稳定的复制标记。通过测定复制子荧光素酶活性就可以在转染后各个时间点检测复制子RNA的复制情况。将荧光素酶置于脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis Virus, EMCV) IRES翻译后的调控比HCV IRES的调控能够更好的增强复制水平、报告基因活性和其他许多可重复再现的结果。复制子系统是研究HCV复制最有效的工具。从HCV复制子概念的引入、适应性突变的鉴别、允许性细胞系的扩展到感染性病毒基因组的产生、抗病毒药物的筛选等,众多的专家学者利用复制子系统进行了无数的研究用以探求HCV复制的机制、定义单个蛋白的功能、鉴别决定HCV复制的病毒和宿主的调控因素、HCV拮抗宿主抗病毒反应的机制、测定HCV与Huh-7细胞及其亚系间的相互作用和筛选有效地抗病毒药物。总之,复制子系统的发展对于评估、研究抗病毒药物和筛选抗药性基因都有很大的现实意义,为特异性靶向性抗病毒治疗(Specifically Targeted Antiviral Therapy for Hepatitis C Virus)提供了高效的实验工具和手段,能够加速治愈慢性HCV感染药物的研发历程,从而有希望完全清除HCV感染。目的：利用1b型HCV亚基因复制子pUC19-HCVreplicon,利用22nt小IRES串联表达多个基因,构建表达海肾荧光素酶(Human RenillaLuciferase, hRluc)和新霉素磷酸转移酶(Neomycin Phosphotransferase, Neo)的新型HCV亚基因复制子pHCV-rep-hRluc。通过在Huh7细胞中稳定表达,构建一个新型HCV复制子细胞模型,并经过系列研究,观察其作为高流量药物筛选模型的特性。方法：利用两个小的IRES串联表达多个基因,以观察这种串联表达的效率。利用分子生物学实验技术,在表达筛选标记新霉素磷酸转移酶的HCV亚基因复制子pUC19-HCVreplicon质粒的基础上,通过两个小的IRES再表达一个检测标志海肾荧光素酶。经体外转录,获得HCV复制子RNA,转染Huh-7细胞,G418加压持续筛选,形成稳定表达hRluc的新型HCV亚基因复制子细胞系。倒置显微镜对比pUC19-HCVreplicon和pHCV-rep-hRluc细胞系的克隆形成率(Cloning Efficiency)情况,通过荧光定量RT-PCR检测新型复制子细胞系中HCV RNA的表达并对比HCVRNA表达水平和hRluc表达水平,通过Renilla Luciferase Assay实验测试不同浓度干扰素a2b (Interferon-α2b,IFN-α2b)、利巴韦林(Riboviron,RBV)和HMG-CoA还原酶抑制剂(HMG-CoA reducase inhibitors)对复制子RNA的抑制作用。结果：倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,发现单一22nt小IRES的表达效率明显高于EMCVIRES,两个小IRES串联表达的效率与EMCV IRES相似或稍微减弱,仍可见明亮的GFP表达,证实了这一策略是可行的。成功构建了新型亚基因复制子质粒pHCV-rep-hRluc。体外转录的HCVRNA转染Huh7细胞后,经G418筛选,获得了HCV复制子稳定复制的细胞株。新型亚基因复制子pHCV-rep-hRluc较pUC19-HCVreplicon的克隆形成率高出约2倍水平。新型HCV亚基因复制子细胞克隆胞浆内HCVRNA的表达水平和hRluc的表达水平的高低一致,一定程度上说明了hRluc可代表HCV RNA复制水平。RBV对稳定表达hRluc的细胞系HCVRNA的表达具有明显抑制作用,IFN-α2b对其抑制作用不明显,但在瞬时转染实验体系中,IFN-α2b和RBV均能够有效抑制HCV RNA的表达。HMG-CoA还原酶抑制剂辛伐他汀(Simvastatin)或阿托伐他汀(Atorvastatin)均能够有效抑制稳定细胞系中HCV RNA的表达。结论：122nt小IRES表达效率优于EMCV IRES,可用于串联表达多个结构基因,并支持报告基因的高效表达；2通过两个22nt小IRES串联表达,成功构建了同时表达新霉素磷酸转移酶和海肾荧光素酶的新型HCV复制子；获得了表达海肾荧光素酶的HCV复制子稳定复制的细胞系；3经过系列研究证实,该细胞系对多种HCV抑制剂敏感,对RBV和HMG-CoA还原酶抑制剂成剂量依赖性；4该细胞系中HCV复制对干扰素不敏感,而瞬时转染的HCV复制子RNA对干扰素敏感。5通过构建这一模型,由于有了荧光素酶的表达,可代替繁琐、费时、费力的RT-PCR体外检测,该模型可作为高通量筛选抗HCV药物的新的细胞模型；本实验RNA瞬时复制实验体系也可以用于抗病毒药物的筛选。

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-13
研究论文构建含有小IRES和报告基因的新型HCV亚基因复制子细胞系  13-39
  前言  13-15
  材料和方法  15-21
  结果  21-24
  附图  24-31
  结论  31-32
  讨论  32-37
  参考文献  37-39
综述 HCV复制子系统的研究进展及其应用  39-47
个人简历  47

构建含有小IRES和报告基因的新型HCV亚基因复制子细胞系

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