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二甲双胍及AICAR激活AMPK诱导肝癌细胞株PLC/PRF/5增殖抑制

作　者: 王钦加
导　师: 荆绪斌
学　校: 汕头大学
专　业: 消化内科
关键词: 二甲双胍 AICAR AMPK 肝癌 细胞增殖
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 206次
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内容摘要


背景及目的腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)属于丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白激酶,广泛存在于真核生物细胞中,是细胞能量调节的感受器,负责能量调节及传递。生理状态下AMPK不活跃,当细胞处于应激状态和能量耗竭使AMP/ATP比例升高时,AMPK可被上游基因激活,使AMP/ATP比例恢复正常。近年来的研究资料表明AMPK激活对肿瘤细胞可产生细胞毒性作用,因此,能使AMPK激活的药物将有可能成为抗肿瘤药物的新选择。LKB1/AMPK途径在正常组织具有抑制肿瘤细胞形成的作用,而在体外,也已被证明其对多数人类肿瘤细胞株具有毒性作用,其中包括肺癌,前列腺癌,胃癌,乳腺癌。而AMPK对肝癌细胞是否也存在抑制作用,及其对肝癌细胞周期的影响,目前报道较少。二甲双胍是双胍类药物的代表药物,其降血糖作用的临床应用已有半个多世纪,在我国,二甲双胍是2型糖尿病的一线治疗药物。而近年来研究表明,二甲双胍除了其降血糖作用外,还具有抑制多种肿瘤细胞增殖的作用,包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等。上述作用被证明是由二甲双胍激活AMPK所诱导,目前二甲双胍对肝癌细胞是否具有生长抑制作用及其机制尚未见报道。本研究将通过二甲双胍对肝癌细胞PLC/PRF/5增殖抑制、细胞周期的影响及其作用分子机制的研究,为AMPK成为抗肿瘤治疗的新靶点以及二甲双胍成为抗肿瘤药物的应用提供理论依据。材料和方法1.用含10%胎牛血清,100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基培养人肝癌细胞株PLC/PRF/5细胞及人宫颈癌细胞株HeLa细胞;HeLa细胞缺乏LKB1基因,而LKB1基因是AMPK上游激酶,因此,实验中采用HeLa细胞做为阴性对照。2.用含10mM的二甲双胍培养基和1000μM的AICAR的培养基作用PLC/PRF/5细胞15min,以未予药物处理细胞为对照,Western Blot检测AMPK磷酸化程度。3.用含不同浓度二甲双胍(2.5、5.0、10、20mM),AICAR(200、500、1000、2000μM)的培养基分别处理PLC/PRF/5细胞24、48、72h;用含10mM的二甲双胍培养基和1000μM的AICAR的培养基分别处理HeLa细胞24、48、72h,以未予药物处理细胞作对照;噻唑蓝比色法(MTT法)检测二甲双胍及AICAR对PLC/PRF/5细胞及HeLa细胞增殖的影响。4. PLC/PRF/5细胞用含10mM的二甲双胍的培养基和1000μM的AICAR的培养基作用72h,经碘化丙啶(PI)单染法,用流式细胞分析仪(FCM)检测PLC/PRF/5细胞周期情况。5. PLC/PRF/5细胞用含10mM的二甲双胍的培养基和1000μM的AICAR的培养基作用72h ,DAPI染色观察PLC/PRF/5细胞凋亡情况。结果1. Western Blot结果显示,经二甲双胍及AICAR处理后,PLC/PRF/5细胞AMPK磷酸化程度较对照组明显增强。2. MTT法检测结果显示,与对照组比较,二甲双胍及AICAR能明显抑制PLC/PRF/5细胞的生长,并且呈浓度依赖性;而二甲双胍及AICAR对HeLa细胞的生长无抑制作用。3.流式细胞术检测结果显示,PLC/PRF/5细胞经二甲双胍及AICAR处理24h后,细胞周期发生停滞,G0-G1期,S期,G2-M期和对照组相比较,差别均具有统计学意义。4. DAPI染色观察可见,PLC/PRF/5细胞经二甲双胍及AICAR处理24h后,镜下可见部分PLC/PRF/5细胞核碎裂,细胞发生凋亡。结论1.二甲双胍及AICAR能够使肝癌细胞PLC/PRF/5 AMPK激活。2.二甲双胍及AICAR通过激活AMPK,诱导肝癌细胞PLC/PRF/5增殖抑制,细胞周期停滞。3.二甲双胍及AICAR可诱导PLC/PRF/5细胞凋亡。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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