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赖草属植物Myb基因的克隆及分子性状分析

作　者: 赖建军
导　师: 杨瑞武
学　校: 四川农业大学
专　业: 植物学
关键词: Myb转录因子赖草属系统分析表达生物信息学分析 Q-RTPCR
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

赖草属Leymus Hochst是禾本科Poaceae小麦族Triticeae Dumortier的一个重要多年生属,全世界有赖草属大约32个种和19个亚种,广泛分布于欧亚大陆和北美,南美也有少量分布。主要形态特征为：具根状茎、异花授粉、颖从锥形到披针形、外稃无芒或具短芒、小穗1到多枚着生于穗轴各节、花药长。赖草属植物通常生长于海滨、河湖沙岸、沙漠沙丘、草原、草甸、山坡及林下,有些赖草属物种具有抗病虫、穗大、粒多、高光效等优良特性。同时,该属大多数植物具有较强的耐寒、耐旱、耐碱,以及抗病、抗虫、抗风沙的能力,且是优良的牧草。对赖草属植物抗逆相关基因的研究具有重要的意义。在植物抗逆反应体系中,通过转录因子调控功能基因的表达,是植物逆境应答反应的关键环节。作为植物体内最大的转录因子家族之一,Myb (v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)类转录因子在植物抗逆胁迫过程中起着重要的作用,调节细胞的形态,参与激素和胁迫的应答。目前,在普通小麦中已经获得了大量的Myb基因序列,而在小麦近缘属物种中获得的同源基因则比较少,导致对麦类植物Myb基因家族成员间的关系还不清楚。因此,进行小麦近缘属物种Myb基因的研究是非常必要的。为了认识和利用赖草属植物的Myb基因,本研究对赖草属5种植物的Myb基因进行了克隆和分子性状分析,主要结果如下：1.根据糜子Actin基因的保守序列为诱饵,在Genbank上找到三条同源性非常高的EST序列,拼接为全序列来设计一对简并性引物P1,并利用糜子Actin基因引物P2,以多枝赖草(Leymus multicaulis)叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并连接到pMD18-T载体上。阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,所得序列与GenBank中注册的Actin基因序列的同源性为81.8%-96%,与其它肌动蛋白的氨基酸序列的同源性达82%以上。序列分析表明,克隆到的为Actin基因,并分别命名为：LmACT1,长961 bp,编码312个氨基酸；LmACT2,长192 bp,编码42个氨基酸。并在GenBank注册,登录号为GU992386,GU992387。2.根据Myb基因R2R3区域的保守性,设计简并性引物或Myb基因全长的特异引物,从赖草属5个物种中分离得到19个Myb基因片段,其中,16个片段包含R2R3域的部分序列,3个片段含有完整的开放阅读框的R2R3-Myb基因序列,氨基酸序列分析表明,19个Myb基因片段均属于R2R3-Myb成员。与典型R2R3-Myb基因的比较,赖草属植物19个Myb基因片段编码的R2R3区域氨基酸序列有3种构型：13个为W-x(19)W-x(19)W-x(12)F-x(18) W-x(18)W构型,4个为W-x(19)W-x(19) W-x(12)M-x(18)W-x(18)W型,2个为W-x(19)W-x(19)R-x(12)L-x(18)W-x(18)W型。目前报道的小麦Myb基因编码的蛋白质中,第70位氨基酸全是苯丙氨酸(Phe-F),而赖草属植物的19个Myb基因编码的蛋白质中的第70位氨基酸出现了三种不同的氨基酸,即苯丙氨酸(Phe-F)13个,亮氨酸(Leu-L)2个和蛋氨酸(Met-M)4个,表明赖草属植物的Myb基因在该位点发生了变化,在同属中不同物种或同种的不同Myb基因成员存在多样性。3.根据核酸序列的相似性,对赖草属植物的3个Myb全基因(LrMyb3,HM071921; LmMyb6,GU011687;LmMyb8,GU011688)进行系统分析。分析结果表明,LmMyb6、LmMyb8和LrMyb3基因与ZmMyb39, HvMyb4, TaMyb2首先聚类,它们序列相似性较高,亲缘关系较近。与LmMyb6、LmMyb8和LrMyb3相似性高的大多是一些与植物抗旱相关的Myb基因,因此,推测本研究中的LmMyb6、LmMyb8和LrMyb3与赖草属植物的抗旱性有关。4.通过荧光定量,运用2-△△Ct分析法对多枝赖草LmMyb8基因在根、茎和叶的荧光相对定量分析,结果表明,LmMyb8在叶和根中的相对表达丰度高,茎较低,与玉米Myb基因在根、茎、叶的表达方式不一样,与小麦的TaMyb2, TaMyb3, TaMyb4和TaMyb6的表达方式相似。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
前言  11-13
第一章文献综述  13-28
  1 植物转录因子的特征与种类  13-17
    1.1 植物转录因子的特征  13-14
    1.2 植物转录因子的种类  14-17
  2 植物Myb转录因子研究进展  17-28
    2.1 植物Myb转录因子的结构特征与分类  17-20
    2.2 植物Myb基因活性的调节  20-21
    2.3 植物Myb转录因子的起源与进化  21-22
    2.4 植物Myb转录因子的功能  22-28
第二章 Actin基因片段的克隆及序列分析  28-35
  1 材料与方法  28-30
    1.1 实验材料  28-29
    1.2 主要试剂  29
    1.3 实验方法  29-30
  2 结果与分析  30-33
    2.1 总RNA的提取  30
    2.2 RT-PCR扩增及克隆  30-32
    2.3 测序结果及序列分析  32-33
  3 讨论  33-35
第三章 Myb基因的分子克隆和序列分析  35-58
  1 材料与方法  35-40
    1.1 材料  35
    1.2 方法  35-40
      1.2.1 种子发芽  36
      1.2.2 基因组DNA的提取  36-37
      1.2.3 多枝赖草总RNA的提取(TRNzol)  37
      1.2.4 第一链cDNA的合成  37-38
      1.2.5 Myb基因同源片段的克隆  38-40
      1.2.6 Myb基因cDNA全长序列的克隆  40
  2 结果与分析  40-54
    2.1 Myb基因同源片段的获得  40-42
    2.2 Myb基因全长序列的获得  42-44
    2.3 Myb基因全长序列分析  44-50
    2.4 Myb氨基酸序列的同源性比对及系统进化树分析  50-52
    2.5 Myb基因核苷酸序列聚类分析  52-54
  3 讨论  54-58
    3.1 采用简并性引物批量分离Myb基因的可行性  54-55
    3.2 赖草属植物Myb家族基因多样性  55-56
    3.3 Myb蛋白结构的特点及其同源性分析  56
    3.4 LmMyb6、LmMyb8和LrMyb3的功能推测分析  56-58
第四章 LmMyb8在不同组织的相对定量检测  58-67
  1 材料与方法  59-61
    1.1 实验材料  59
    1.2 主要试剂与仪器  59
    1.3 试验方法  59-61
      1.3.1 荧光定量PCR引物的设计和合成  59-60
      1.3.2 引物的特异性检测  60
      1.3.3 实时荧光定量PCR标准曲线的制作  60
      1.3.4 荧光定量PCR cDNA模板的制备  60-61
      1.3.5 实时荧光定量PCR反应  61
      1.3.6 统计分析  61
  2 结果分析  61-65
    2.1 荧光定量PCR引物的验证  61-62
    2.2 SYBR Green I real-time PCR标准曲线的建立及线形范围  62-64
    2.3 LmMyb8基因的表达情况检测  64-65
  3 讨论  65-67
参考文献  67-78
附表1 植物Myb类转录因子及其生物学功能  78-83
附图赖草属植物Myb基因的DNA序列和氨基酸序列  83-87
致谢  87-88
在读期间发表文章  88

赖草属植物Myb基因的克隆及分子性状分析

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