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发育潜能不同的猪2-细胞期孤雌胚胎差异表达基因的筛选

作　者: 陆芳
导　师: 王希彪
学　校: 东北农业大学
专　业: 动物遗传育种
关键词: 猪孤雌胚胎初次卵裂时间胚胎质量 DDTR-PCR
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

胚胎的初次卵裂时间是衡量胚胎质量和后续发育能力的重要指标之一,以初次卵裂时间为基础选择发育能力不同的胚胎做研究对象,再通过相应的试验技术可以使我们发现一些影响胚胎发育能力的母源基因。猪的胚胎基因组激活(Embryonic genome activation, ZGA)在4-细胞期,如果之前的发育均由源自卵子的母源mRNAs调控,则早卵裂的胚胎与晚卵裂胚胎间各种mRNA丰度的不同将极可能表现在2-细胞期。鉴定出该时期表达丰度不同的mRNAs,可以使我们获得与胚胎发育能力有重要关系的母源基因,同时也有助于我们发掘胚胎早期发育过程中初次卵裂时间影响胚胎后续发育能力的原因。本试验以猪孤雌胚胎为材料,根据初次卵裂时间的早晚划分出发育能力不同的两组胚胎,比较其mRNAs丰度。利用mRNA差异显示技术(mRNA Differential Display Reverse Transcription PCR, DDRT-PCR)筛选出两组胚胎中表达丰度不同的mRNAs。采用反Northorn-blot技术进行阳性片段的鉴定。利用PCR和5’RACE(Rapid-Amplification of cDNA Ends)技术对阳性片段E3所在的CPEB2基因进行全长cDNA克隆。利用SYBR Green荧光定量PCR技术得到了该基因在早期胚胎中的表达模式。1.经反Northern-blot验证,发现有8条差异表达的阳性cDNA片段(E1-E4; L1-L4),其中四条(E1-4)在早卵裂(发育潜能较高)胚胎中表达量较高;四条(L1-L4)在晚卵裂(发育潜能较低)胚胎中表达量较高。2. 8条阳性片段克隆、测序后与GenBank中猪的基因数据库进行同源性比对分析,其中6条(E1, E2, E3, L1, L2, L4)与已知猪的ESTs有较高的同源性。3.经过与GenBank中人的基因数据库对比,发现在卵裂较快的胚胎中表达量较高的E3与人CPEB2的同源性为97%;在卵裂较慢的胚胎中表达量较高的L3与人hnRNPA1的同源性89%。4.首次成功克隆了猪CPEB2 cDNA,提交到NCBI,获得基因登录号:HM037344。5.首次确定猪胚胎中存在CPEB2基因,经荧光定量PCR进一步证明E3的表达量在早卵裂和晚卵裂胚胎中明显不同,表达模式与其他功能性转录子一致。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-11
1 前言  11-20
  1.1 研究背景与科学意义  11
  1.2 文献综述  11-18
    1.2.1 胚胎早期发育的相关研究  11-14
    1.2.2 孤雌生殖  14-15
    1.2.3 有关胚胎初次卵裂时间的研究  15-16
    1.2.4 mRNA 差异显示技术  16-18
  1.3 研究的目标与内容  18-20
2 材料与方法  20-38
  2.1 试验材料  20-23
    2.1.1 孤雌胚胎的培养与收集  20-21
    2.1.2 试验试剂  21
    2.1.3 缓冲液与常用试剂的配制  21-23
    2.1.4 主要仪器设备  23
  2.2 试验方法  23-38
    2.2.1 差异表达 mRNA 的筛选  23-26
    2.2.2 差异表达片段的鉴定及测序  26-28
    2.2.3 CPEB2 cDNA 的克隆  28-34
    2.2.4 不同阶段胚胎中 CPEB2 的荧光定量 PCR  34-38
3 结果与分析  38-54
  3.1 差异表达mRNA 的筛选结果  38-40
    3.1.1 两组胚胎DDRT-PCR 聚丙烯酰胺凝胶电泳的比较结果  38-39
    3.1.2 差异条带的回收及二次PCR 的结果  39-40
  3.2 差异条带的鉴定、克隆、测序及生物信息学分析结果  40-43
    3.2.1 探针标记效价的检测结果  40
    3.2.2 反向Northern-blot 鉴定结果  40-41
    3.2.3 阳性片段的克隆及测序  41
    3.2.4 差异表达序列的生物信息学分析  41-43
  3.3 CPEB2 cDNA 克隆结果  43-50
    3.3.1 细胞RNA 提取结果  43
    3.3.2 CPEB2 中间片段扩增结果  43-45
    3.3.3 CPEB2 cDNA 5'末端的扩增(5'RACE)结果  45-46
    3.3.4 序列拼接  46
    3.3.5 CPEB2 的生物信息学分析  46-50
  3.4 不同发育阶段胚胎 CPEB2 的荧光定量 PCR 结果  50-54
    3.4.1 标准曲线的绘制结果  50-51
    3.4.2 不同阶段胚胎 CPEB2 的定量结果  51-54
4 讨论  54-58
  4.1 DDRT-RCR 技术及结果鉴定  54
  4.2 试验材料的选择  54-55
    4.2.1 胚胎卵裂时间点的划分  54-55
    4.2.2 孤雌胚胎的选择  55
  4.3 关于差异表达mRNA 片段  55-56
  4.4 猪 CPEB2 功能的预测  56-58
    4.4.1 猪 CPEB2 cDNA 和蛋白序列分析  56
    4.4.2 不同阶段胚胎中 CPEB2 表达规律  56-58
5 结论  58-59
致谢  59-60
参考文献  60-69
附录1  69-71
附录2  71-74
攻读硕士学位期间发表的学术论文  74

发育潜能不同的猪2-细胞期孤雌胚胎差异表达基因的筛选

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