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耐辐射奇球菌Dps-2蛋白的互作蛋白筛选

作　者: 蒋亮
导　师: 李斌元；何淑雅
学　校: 南华大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 耐辐射奇球菌 Dps-2蛋白氧化应激酵母双杂交互作蛋白
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景及目的:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是目前世界上已知最强的抗辐射生物之一,以其对于电离辐射等诸多逆境因素的超强耐受和抵抗力而著称,其抗性机理主要可归因于其特殊的物质结构和生存方式、对DNA损伤的精确高效修复以及卓有成效的抗氧化体系。Dps (DNA protection during starvation)蛋白是DR菌抗氧化体系的重要成分。在DR菌内有两种Dps蛋白,分别由DR2263和DRB0092基因编码;由于大多数细菌只表达一个Dps蛋白,而且DR内的两种Dps蛋白在序列同源性及基因来源等生物信息学比较上存在差异,推测Dps蛋白在DR内行使的功能及作用途径会与其它种属不同,这种种属间的差异对于解释DR菌超强抗性的机制可能具有重要意义。本研究以编码Dps-2的DRB0092(dps)基因作为研究对象,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-dps,利用酵母双杂交系统筛选与Dps-2蛋白有相互作用的蛋白质,以期了解Dps-2蛋白可能与哪些蛋白质因子相互作用共同完成抗氧化功能。这将有助于明确DR菌高效抗氧化系统的分子机制,为DR菌辐射抗性的复杂调控网络研究提供新的资料。方法:利用基因工程方法构建诱饵载体pGBKT7-dps,经测序验证正确后,将pGBKT7-dps/pGADT7转化入酵母菌AH109中,观察其是否影响酵母宿主菌的生长以及是否具有自身相互作用、自激活性质;在本实验室前期构建好的两种DR菌基因组文库(pGADT7–DNADR/Sau3AI和pGADT7–DNADR/HpaⅡ)基础上,通过酵母双杂交技术从DR菌基因组表达文库中筛选可能与Dps-2相互作用的蛋白。结果:诱饵载体pGBKT7-dps构建成功,通过检测发现其对酵母宿主菌无毒性,该载体无自激活活性,但可发生自身相互作用;利用酵母双杂交筛选可与Dps-2蛋白发生相互作用的7个蓝色阳性克隆。结论: 1.本实验成功构建了酵母双杂交系统钓饵质粒pGBKT7-dps,该质粒对于酵母菌株AH109无自激活活性;2. Dps-2蛋白具有自身相互作用,在菌体内可形成二聚体; 3.利用酵母双杂交技术从耐辐射奇球菌基因组文库中筛选得到可以与Dps-2蛋白发生相互作用的7个相互作用蛋白质(肽),其中五个较有意义的互作蛋白功能集中与生物大分子的代谢、结合、降解相关。

全文目录

主要英文缩略词  5-6
中文摘要  6-7
英文摘要  7-9
1 引言  9-18
2 材料与方法  18-34
  2.1 材料  18-23
  2.2 方法  23-34
3 结果  34-43
  3.1 DR 菌基因组DNA 的制备  34
  3.2 酵母双杂交重组质粒 pGBKT7-dps 和 pGADT7-dps 的构建  34-38
  3.3 利用酵母双杂交筛选Dps-2 蛋白的相互作用蛋白  38-41
  3.4 测序及生物信息学分析  41-43
4 讨论  43-51
  4.1 耐辐射奇球菌Dps 蛋白的研究  43-45
  4.2 酵母双杂交系统的局限及解决方案  45-46
  4.3 阳性克隆的基因分析  46-51
5 结论  51-52
参考文献  52-56
文献综述  56-69
成果目录  69-70
致谢  70

耐辐射奇球菌Dps-2蛋白的互作蛋白筛选

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