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阿魏酸、当归多糖对神经干细胞缺氧性损伤的保护作用

作　者: 李燕
导　师: 郭勇
学　校: 泸州医学院
专　业: 人体解剖学与组织胚胎学
关键词: 神经干细胞细胞培养缺氧阿魏酸当归多糖
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：探讨阿魏酸(ferulic acid,FA)、当归多糖(angelica sinensis polysaccharide,ASP)对体外培养神经干细胞(neural stem cells,NSCs)缺氧性损伤的保护作用及其作用机制。方法：(1)NSCs培养、鉴定及分化。①NSCs培养及鉴定：取生后24h内SD大鼠,75%酒精消毒,无菌条件下取出脑组织,眼科剪充分剪碎,反复吹打,200目不锈钢滤网过滤后离心两次,无血清培养基重悬接种,每隔2-3d半量换液,6d左右分离传代一次。倒置显微镜下观察NSCs形态及生物学特性,免疫细胞化学方法(SABC法)检测巢蛋白(Nestin)。②体外NSCs的分化：血清培养基诱导分化6天后观察细胞形态学改变,SABC法检测神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilous acidic protein, GFAP)。(2)缺氧损伤模型的建立：将培养第3代的NSCs随机分为对照组和缺氧4、8、12、16和20h组。缺氧组放入三气培养箱中,对照组则置于常氧培养箱中培养。CCK-8比色法检测缺氧后各组NSCs的活性变化,以确定缺氧时间。(3)实验分组：将培养第3代的NSCs随机分为对照组、缺氧组和加药组(FA组和ASP组),加药组分为高浓度(500mg/L)、中浓度(50mg/L)和低浓度(5mg/L)组。缺氧组和加药组缺氧处理8h,对照组则在常氧培养箱中培养。收集各组细胞检测下列指标：①NSCs形态学的变化；②CCK-8检测NSCs活性变化：③血清培养基诱导各组NSCs分化,SABC法检测神经元标志物NSE和星形胶质细胞标志物GFAP。(4)图像分析：对各免疫细胞化学染色的爬片采用Ax07TRF-A显微成像系统在200倍下观察,每张爬片随机取5个视野照相并计数阳性细胞数。(5)数据统计分析：用SPSS13.0统计分析软件包处理数据。所有参数均以均数±标准差表示,经单因素方差分析(ANO-WAY),行配对t检验。结果：(1)NSCs的体外增殖。原代培养第1天可见分离的细胞呈圆形,折光性强。原代培养3d,可见近球形的细胞团,结构松散,大小不均,周围有细胞呈碎渣样死亡,5-6d可见细胞连接紧密,呈球形增大,折光性好,细胞周围碎片随换液逐渐减少。传代后神经球增殖速度较原代加快,球体较均匀,背景干净,NSCs特异性标志物Nestin染色呈阳性。将细胞传代培养至第3代,细胞克隆形成能力和细胞增殖活性均较佳。(2)体外NSCs的分化：血清培养基诱导分化6天后,可见NSE染色阳性的神经元,胞体呈钝型或多角形改变,有一个或两个突起。GFAP染色阳性的星型胶质细胞,胞体呈星型,胞体较大,突起粗短、较多分支。(3)缺氧损伤时间的确定：NSCs在95%N2、5%C02的培养箱中缺氧不同时间后,CCK-8比色法检测细胞活性：结果显示缺氧8h或更长时间,光密度值(optical density,OD)明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),损伤程度与缺氧的时间呈正相关。(4)FA和ASP对NSCs缺氧性损伤的保护作用：①细胞形态学观察：对照组NSCs形态正常,生长良好。缺氧组神经球数量减少,球体松散,折光性减弱,形状不规则,严重时呈絮状改变。加药组与缺氧组比较,除ASP低浓度组外,细胞损伤程度均有不同程度的减轻,且与加药浓度成反比；其次,FA较同等浓度ASP对NSCs保护作用更强。②CCK-8比色法检测细胞活性：缺氧组较对照组NSCs活力明显下降,具有显著性差异。除ASP低浓度组外,其它FA组和ASP组均能明显提高细胞的活力,且与药物浓度呈正比量效关系。③FA、ASP对NSCs分化的影响：三种不同剂量的FA、ASP干预后,细胞表达NSE、GFAP的阳性细胞数量,除ASP低浓度组与缺氧组比较无统计学意义(P>0.05))外,其它组较对照组明显增加(P<0.05),并且FA、ASP浓度越大,分化形成的神经细胞数越多。结论：(1)在95%N2、5%CO2条件下缺氧8h可以建立NSCs缺氧模型,为深入研究缺氧对NSCs损伤提供实验支持；(2)FA和ASP作为当归有效成分,能对缺氧损伤的NSCs发挥保护作用,在一定浓度内呈正相关,其作用机制可能是通过激活内源性NSCs增殖发挥其损伤保护作用,这为临床应用当归预防和治疗缺氧损伤性疾病提供重要实验依据。

全文目录

中文摘要  3-6
英文摘要  6-10
前言  10-13
材料和方法  13-20
实验结果  20-28
讨论  28-35
结论  35-36
参考文献  36-39
英文缩写单词  39-40
致谢  40-41
神经干细胞培养影响因素的研究综述  41-51

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