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重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α对血管新生的影响
作 者: 魏璇
导 师: 吴平生
学 校: 南方医科大学
专 业: 心血管内科
关键词: 低氧诱导因子-1α 重组腺病毒 血管新生 人微血管内皮细胞 鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)
分类号: R541.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
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背景缺血性心脏病是危害人类健康的常见病,也是目前导致人类死亡的主要疾病之一。随着医学的进步,溶栓疗法、冠状动脉旁路移植术(CABG)、经皮腔内冠脉成形术(PTCA)、冠状动脉支架植入术(ICS)等治疗手段改善了冠心病患者的存活率,提高了生活质量。但目前对于那些冠脉多支血管病变、弥漫性病变或小血管病变、支架内再狭窄及慢性完全闭塞不宜采用上述治疗的冠心病患者来说,侧支循环的建立就具有重要的临床意义。治疗性血管新生主要是通过某些干预措施,促进缺血区新的小血管生长,达到恢复缺血心肌血供、改善患者症状和预后的目的。目前,它已成为缺血性心血管疾病治疗领域的热点课题。近年来研究发现,发现一些多肽生长因子具有促血管生成作用,外源性给予这些生长因子可以有效地促进新生血管形成及缺血组织的侧支循环建立,改善组织缺血,为缺血性心脏病的治疗提供了新的策略。血管新成是一个复杂的过程,需要多种生长因子和调节蛋白的参与,而且在血管新生的不同阶段,各种因子发挥的作用也有所不同。研究表明单个的生长因子治疗不足以诱导成熟的血管新生,成熟的血管生成需要大量不同的细胞类型以及大量生长因子及它们的受体之间相互作用才能完成。目前已知可能参与血管生成过程的调节分子包括：血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、促血管生成素(angiopoietin)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)等。大量动物实验和临床研究显示VEGF、FGF蛋白和基因可增加缺血心肌灌注、减小梗死面积、改善心功能,然而资料显示VEGF可导致血管渗漏、组织水肿等,FGF治疗则与蛋白尿有关。低氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor 1, HIF-1)是调控血管生成的关键基因,它作为细胞对缺氧适应性反应的上游关键性转录因子,通过对VEGF、Ang、EPO、PDGF、HO-1等60多种靶基因的转录调控,参与了血管新生、红细胞生成等病理生理过程。临床前期研究表明,应用具有组成型表达活性的HIF-1α基因治疗可诱导生理功能完整的血管新生。HIF-1α诱导的新生血管具有无明显炎症反应、不渗漏、不引起组织水肿的特点。因此HIF-1α被认为是最有前景的促血管新生治疗的基因之一HIF-1由α亚基和β亚基构成异二聚体,其中HIF-1β是结构性亚基,其在细胞核中持续表达,不受缺氧的影响；HIF-1α是功能性亚基,其蛋白稳定性和转录活性主要受细胞内氧浓度的调节。缺氧状态下,HIF-1α结构保持稳定并且从细胞浆移至细胞核,在细胞核内与HIF-1β形成异二聚体后具有转录活性；常氧状态时,在脯氨酸羟化酶1,2,3(PHDsl-3)的作用下,HIF-1α氧依赖降解结构域(oxygen-dependent degradation domain, ODDD)的402和／或564位点的脯氨酸残基被羟化,与von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白(pVHL)结合,经泛素蛋白酶途径降解。同时羟化酶还可以作用于HIF-1α转录激活区803位点的天冬酰胺残基(Asn803),通过HIF-1α抑制因子(factor inhibiting HIF-1α,FIH)抑制HIF-1α与辅助激活因子(CBP／P300)结合,从而抑制其转录活性。在此基础上,本课题组将HIF-1α的564、402、803三个位点联合突变,成功构建了腺病毒介导的三突变型HIF-1α564/402/803 (Ad-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803),使其在常氧下能够稳定高效表达。本实验为进一步明确HIF-1α在调控血管新生中的作用及Ad-HIF-1α564/402/803在常氧下的生物学效应,将其转染体外培养的人微血管内皮细胞(hMVECs),研究其对人微血管内皮细胞在Matrigel上毛细血管管腔样结构的形成影响,并应用鸡胚绒毛尿囊膜模型,观察其对血管新生的影响.目的为了深入研究HIF-1α基因在血管新生中的作用及Ad-HIF-1α564/402/803的生物学效应,本课题观察常氧情况下在Matrigel三维培养模型中Ad-HIF-1α564/402/803是否能促进人微血管内皮细胞形成毛细血管管腔样结构,了解HIF-1α对血管新生的影响,并通过构建鸡胚绒毛尿囊膜模型,进一步观察Ad-HIF-1α564/402/803对血管新生的影响。方法第一部分：将构建的重组腺病毒载体Ad-HIF-1α564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-LacZ及空腺病毒载体Ad-Null,在HEK293A细胞中大量扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,通过PCR及基因测序鉴定病毒,终点稀释法测定病毒滴度。Ad-LacZ以不同转染复数(MOI)转染hMVECs,经X-gal染色测定转染效率；第二部分：2.1 hMVECs体外毛细血管管腔生成实验将96孔培养板每孔内加入Matrigel(冰上过夜溶解),震荡使其均匀平铺(以上操作在冰浴上进行),置于37℃培养箱内,30 min后取出,观察已形成凝胶状,每孔Matrigel上接种hMVECs,以最佳MOI值将Ad-HIF-1α-564/402/803、Ad-HIF-1α-nature、Ad-Null分别转染细胞,对照组加入等量完全培养基。转染后置于37℃,5%CO2培养箱内培养,计数管腔数,SPSS13.0软件进行统计学分析。2.2鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验选取孵育第8天的受精鸡蛋,放入消毒蛋托,于37.8±0.5℃生化恒温培养箱中孵育,相对湿度为50%～60%。24小时后,用注射针头在气室区域内开一小孔,用眼科镊揭去气室部蛋壳及外壳膜后,用眼科镊小心将内壳膜揭去。以上操作均在无菌操作下进行。将滴度为1 x1010pfu/ml的Ad-HIF-1α-564/402/803、Ad-HIF-1α-nature、Ad-Null分别滴加于载体上,对照组滴加等量的PBS。然后用透明胶带(经高温高压灭菌)封口,继续孵育72 h后撕开透明胶带纸,检查弃去死亡胚蛋,将标本拍照记录载体周围的血管图像,使用Image Pro Plus6.0软件收集数据并计算各组CAM血管面积比(血管面积／开窗部位CAM面积),利用SPSS13.0软件进行统计分析。结果第一部分：在HEK293A细胞内扩增后获得重组腺病毒Ad-HIF-1α564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null、Ad-LacZ,纯化后终点稀释法测得各组重组腺病毒滴度分别为：1.5×1012PFU/ml,1.2×1011 PFU/ml,2.0×1012PFU/ml,6.3×1011PFU/ml。重组腺病毒病毒转染HEK293A细胞后24h即出现病变效应(CPE)。提取Ad-HIF-la564/402/803 DNA, PCR检测HIF-1α基因得到预期的380bp、460bp、214bp的目的片段,且DNA测序结果符合实验要求。Ad-LacZ以不同MOI转染hMVECs, X-gal染色显示MOI为100pfu/cell时,转染效率趋于稳定。第二部分：2.1 hMVECs体外毛细血管管腔生成实验hMVECs细胞接种于Matrigel胶起始呈圆形或卵圆形,6h后逐渐贴附于基质胶表面并伸展开,伸出突起,相邻突起相互连接形成小管样结构。统计分析结果显示：Ad-HIF-1α-564/402/803转染HUVECs后所形成的管腔数(24.00±3.44)显著多于Ad-HIF-1α-nature(3.80±1.02)、Ad-Null(5.00±0.71)及对照组(6.40±1.63),Ad-HIF-1α-564/402/803与Ad-HIF-1α-nature、Ad-Null及对照组相比差异有统计学意义(P值均为0.000)；而Ad-HIF-1α-nature、Ad-Null及对照组之间差异无统计学意义(P值均>0.05),24 h后随着作用时间的延长,培养体系的管腔数无明显改变。2.2鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验Ad-HIF-1α-564/402/803较Ad-HIF-1α-nature、Ad-Null及PBS组加药载体周围微小血管密度明显增多,血管分支增加。应用Image Pro Plus6.0进行新生血管面积定量,统计分析结果表明,Ad-HIF-1α-564/402/803血管面积比(23.80±1.65)与Ad-HIF-1α-nature (15.74±3.19)、Ad-Null (11.43±0.92)及PBS组(11.45±1.44)相比显著增大,且Ad-HIF-1α-564/402/803与Ad-HIF-1α-nature、Ad-Null及PBS组相比较差异具有统计学意义(P值分别为0.011、0.000、0.000)；而Ad-HIF-1α-nature、Ad-Null及PBS组之间无明显差异(P值均>0.05)。结论第一部分：本课题组构建的重组腺病毒载体Ad-HIF-1α564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null、Ad-LacZ扩增后能获得较高的滴度,且转染效率高,为下一步实验提供了保证。第二部分：Ad-HIF-1α564/402/803在常氧条件下可促进Matrigel胶上HMVECs细胞官腔样结构的形成,并能促进鸡胚绒毛尿囊膜模型中血管生成,验证了重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α的生物学效应。
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全文目录
摘要 3-8
ABSTRACT 8-16
引言 16-20
第一部分 重组腺病毒载体扩增、鉴定、纯化、滴度测定 20-41
1 材料 21-27
1.1 重组腺病毒基因 21
1.2 主要试剂 21-22
1.3 仪器设备 22-23
1.4 试剂配制 23-27
2 方法 27-32
2.1 HEK293A细胞复苏、培养、冻存 27-28
2.2 腺病毒介导的人突变型HIF-1α基因的扩增和保存 28
2.3 重组腺病毒纯化 28-29
2.4 重组腺病毒滴度测定 29-30
2.5 重组腺病毒DNA提取和鉴定 30-32
2.6 Ad-LacZ转染HEK293A细胞及X-gal染色 32
3 结果 32-37
3.1 重组腺病毒滴度测定 32-33
3.2 重组腺病毒Ad-HIF-1α_(564/402/803)DNA PCR鉴定 33-34
3.3 重组腺病毒Ad-HIF-1α_(564/402/803)测序结果 34-35
3.4 Ad-LacZ转染HEK293A细胞X-gal染色结果 35-36
3.5 重组腺病毒感染HEK293A细胞 36-37
4 讨论 37-40
5 结论 40-41
第二部分 重组腺病毒三突变型HIF-1α对血管新生的影响 41-58
1 材料 41-43
1.1 主要试剂 41-42
1.2 细胞株和实验动物 42
1.3 主要仪器 42
1.4 主要试剂配制 42-43
2 方法 43-47
2.1 人微血管内皮细胞(hMVECs)的培养 43-44
2.2 重组腺病毒转染染效率的测定 44
2.3 重组腺病毒Ad-HIF-1α_(564/402/803)对血管新生的影响 44-47
3 结果 47-52
3.1 hMVECs免疫荧光组化鉴定结果 47-48
3.2 重组腺病毒转染效率的测定 48-49
3.3 重组腺病毒Ad-HIF-1α_(564/402/803)对血管新生的影响 49-52
4 讨论 52-57
5 结论 57-58
参考文献 58-65
本研究不足之处 65-66
缩略词表 66-68
致谢 68-70
统计学证明 70
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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 心脏疾病 > 冠状动脉（粥样）硬化性心脏病（冠心病）
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