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高纤维素降解放线菌的筛选与功能鉴定

作　者: 郭昌
导　师: 林文雄
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 纤维素降解放线菌 产酶 优化模型比较 内切葡聚糖酶
分类号: S182
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本研究从不同生境中筛选得到一株高纤维素降解放线菌SD1-4,通过形态、生理和分子研究,初步鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)。对SD1-4液态发酵产酶条件进行优化,结果表明:初始pH为8.0,最适温度为39℃,最适氮源为酵母膏,最佳无机盐添加量为60mgKCI和15mg CaCl2,最佳灭菌时间为40min、最适装液量为50ml/250ml;0.15%Triton X-100抑制产酶,0.05%Triton X-100促进产酶,PEG8000和吐温-20两种浓度均呈促进作用,SDS均呈抑制作用;第9天产酶达到高峰。对天然碳源(菌草)的研究表明:象草叶为最适碳源;筛选能源草的具体指标为高纤维素、低直链淀粉、低葡萄糖、低果糖、高蔗糖、高蛋白质含量;筛选种质资源的统计学工具为相关分析、主成分分析、回归分析和聚类分析,而灰色关联分析和通径分析不适合。象草营养成分含量(可溶性糖为9.04%、可溶性蛋白质为3.37%时,淀粉含量为5.95%时,粗纤维素含量为65.95% )为象草发酵的最佳成分含量。采用Box-Bohnken设计,以最终的纤维素酶产量作为研究目标,构建纤维素酶产量(内切酶、外切酶和糖苷酶)和7个因子(温度、pH、颗粒大小、蛋白胨浓度、湿度、接种量和时间)之间的关系模型,比较了GA-ANN、ANN和RSM在优化能力上的差异,优化条件下为0.869、0.906和0.867(R值),相比不优化条件的0.796、0.881和0.840,表明GA-ANN在捕捉系统非线性行为的独特优势。通过PEG浓缩、硫酸铵沉淀、乙醇洗涤和Sephadex G-200、DEAE A-50、Sephadex G-200,从SD1-4胞外粗酶液中分离得到一种内切葡聚糖酶,经SDS-PAGE检测为单一条带,分子量约为38KD,能水解CMC-Na,最适温度为60℃和pH值为7.0,Vmax、Km分别为22.57U·ml-1·min-1和0.14%;0.2mM Co2+对该酶有较强的促进作用,0.8 mM Co2+对该酶有弱抑制作用。

全文目录


中文摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
1 前言  10-22
  1.1 生物质  10-11
  1.2 纤维素降解生物  11-13
    1.2.1 纤维素降解菌种类  12
    1.2.2 不同碳源对纤维素降解生物分泌纤维素酶的影响  12-13
  1.3 纤维素酶  13-18
    1.3.1 纤维素酶类型  13-14
    1.3.2 纤维素酶结构  14
    1.3.3 纤维素酶降解机制  14-15
    1.3.4 纤维素酶分离纯化研究进展  15
    1.3.5 纤维素酶的应用  15-16
    1.3.6 纤维素酶研究存在的问题  16-17
    1.3.7 纤维素酶发酵生产类型  17-18
  1.4 试验设计的统计学方法和评价  18-20
  1.5 本研究的意义和内容  20-22
2 材料和方法  22-40
  2.1 试验时间、地点  22
  2.2 试验材料  22
    2.2.1 供试菌株  22
    2.2.2 所需仪器及药品  22
  2.3 试验方法  22-40
    2.3.1 试验设计  22-23
    2.3.2 溶液配置  23
    2.3.3 纤维素降解菌筛选  23-24
    2.3.4 形态鉴定  24-25
    2.3.5 生理生化鉴定  25-27
    2.3.6 分子鉴定  27-29
    2.3.7 液态发酵培养基组成及培养条件  29-30
    2.3.8 不同碳源对链霉菌SD1-4 纤维素酶分泌的调控研究  30-34
    2.3.10 预测模型和优化方法  34-36
    2.3.11 内切葡聚糖酶分离纯化  36-38
    2.3.12 酶活测定方法  38-39
    2.3.13 统计学分析  39-40
3 结果与分析  40-71
  3.1 纤维素降解放线菌分离和鉴定  40-44
    3.1.1 菌株复筛结果  40
    3.1.2 菌株SD1-4 形态鉴定  40-41
    3.1.3 菌株SD1-4 生理生化鉴定  41-42
    3.1.4 菌株SD1-4 分子鉴定  42-44
  3.2 液态产酶条件优化  44-48
    3.2.1 不同温度和初始pH 值对产酶的影响  45
    3.2.2 培养时间对纤维素酶产量的影响  45-46
    3.2.3 不同氮源对产酶的影响  46
    3.2.4 不同浓度无机盐组合（氯化钾和氯化钙）对产酶的影响  46-47
    3.2.5 不同种类和不同浓度表面活性剂对产酶的影响  47
    3.2.6 不同装液量对产酶的影响  47-48
  3.3 不同碳源对链霉菌SD1-4 纤维素酶分泌的调控研究  48-55
    3.3.1 化学试剂与天然物质对产酶的影响比较  48
    3.3.2 19 种天然物质成分与酶活的相关分析  48-54
    3.3.3 混料设计优化配比  54-55
  3.4 固态产酶模型构建与比较  55-67
    3.4.1 试验设计与结果  55-57
    3.4.2 相关分析  57-58
    3.4.3 预测模型  58
    3.4.4 精度比较  58-60
    3.4.5 敏感性分析  60-62
    3.4.6 纤维素酶产量与各因子的关系阐明  62-67
    3.4.7 模型证实  67
  3.5 链霉菌SD1-4 内切葡聚糖酶分离纯化及其酶学性质研究  67-71
4 讨论  71-76
  4.1 菌株筛选与鉴定  71
  4.2 发酵条件研究  71-74
    4.2.1 培养条件  71-72
    4.2.2 培养基组成  72-74
    4.2.3 预处理方法  74
  4.3 优化模型  74-75
  4.4 分离纯化  75-76
5 结论与展望  76-77
参考文献  77-88
致谢  88

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中图分类: > 农业科学 > 农业基础科学 > 农业生物学 > 农业微生物学
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